實驗概要
本文介紹了多酚氧化酶提取、純化和活力測定的原理及方法等。
實驗原理
很多植物受到機械損傷時在空氣中會逐漸變成褐色，這是損傷時植物細胞破碎，原來彼此分開的多酚氧化酶和多酚類物質接觸反應的結果。反應如下：
＋H2O
多酚氧化酶
＋1/2O2
多酚氧化酶(po1yphenoloxidase，PP0)是一種含銅酶，它能夠催化酚類物質轉變成醌。近幾十年來，國內外對植物組織褐變的研究表明，組織的褐變主要是PP0作用于天然底物酚類物質所致。
主要試劑
1. 0.025mol/L磷酸鉀緩沖液（ pH7.2）
2. 0.15mol/L兒茶酚溶液
3. 10mmol/LTris-HCl溶液（pH8.3）
4. 硫酸銨
主要設備
1. 組織勻漿機
2. 漏斗
3. 濾紙
4. 分光光度計
實驗材料
梨
實驗步驟
1. 多酚氧化酶(PP0)的提取
1) 丙酮粉制備：取果肉組織100 g，加入200mL冰丙酮(-20℃左右)，用高速組織搗碎機勻漿5min，混合液用中速濾紙在漏斗架上過濾，殘渣用冰丙酮反復沖洗，過濾，直至成為白色粉末，此粉末即為丙酮粉。
2) 酶液制備：稱取1g丙酮粉，加入20ml 0.025mol/L磷酸緩沖液（ pH7.2），0℃下用磁力攪拌器勻漿30min，在12 000rpm下離心30min，取上清液，得粗酶提取液。
2. 多酚氧化酶(PP0)的純化
向上述酶液中加入NH4SO4至為80％飽和溶液，攪拌30min, 過夜，于12 000g離心30min，沉淀溶于0.025mol/L磷酸緩沖液中（pH7.2）, 對10mmol/LTris-HCl溶液（pH8.3）透析18h, 期間更換三次，即為純化多酚氧化酶。
3. 多酚氧化酶(PP0)活力的測定
以兒茶酚為底物，在25px的比色杯中加入2.75mL 0.025mol/L磷酸緩沖液中（pH7.2）， 0.1mL 0.15mol/L兒茶酚溶液，混勻，室溫下放置3分鐘后，加入0.1mL酶液, 5s后開始掃描1min內A420值的變化，酶活性以每分鐘光吸收值改變0.001所需的酶量為1個活力單位。
注意事項
多酚氧化酶易失活，提取酶時宜在低溫下進行。
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