大鼠星型膠質細胞培養實驗

Wistar大鼠乳鼠

FBS DMEM 胰蛋白酶 EDTA 酒精

眼科剪 滴管 離心機 培養皿 CO2培養箱

一、實驗步驟

1. 新生1-2 天Wistar大鼠乳鼠，經75%酒精消毒，斷頭處死。

2. 取腦放入冷的D-Hanks'平衡鹽溶液，去除腦膜及大血管。

3. 分離兩側大腦皮質并剪成1mm³ 大小，加入0.25%胰蛋白酶37℃空氣浴震蕩消化10 min。

4. 用含10% FBS的DMEM培養基終止消化，離心(1 000 rpm，10 min)，去上清。

5. 用含10% FBS的DMEM培養基重懸沉淀，經75μm篩網過濾，收集濾液，再次離心10 min，收集沉淀用含10% FBS的DMEM培養基重懸，調整細胞密度至1.5x10⁶/ml，種植于75 cm² 培養瓶。

6. 經1 小時差速黏附去除成纖維細胞后，將細胞懸液轉移到一新的75 cm² 培養瓶繼續培養，兩天換液一次。

7. 7 天后將培養瓶放入水平搖床(260 rpm，2 h，37℃)，換液棄除小膠質細胞，放入培養箱平衡1 小時，重新置于水平搖床18 h。

8. 換液棄除少突膠質細胞，用新鮮培養基洗2 遍，加入0.25%胰蛋白酶與0.02% EDTA 1:1 混合液消化、傳代備用。

二、 形態學觀察

倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態和生長狀況。

三、 細胞生長曲線繪制

傳代后的細胞以 2x10⁴/ml 的密度種植于24 孔培養板中培養，3 天換液1 次， 每24 小時取3 孔計數，連續7 天，取均值繪制生長曲線。

四、星型膠質細胞的鑒定

膠質纖維酸性蛋白(GFAP)免疫細胞組織化學鑒定方法。取星型膠質細胞去除培養基，用PBS洗3 遍，4%多聚甲醛室溫固定1 小時，PBS洗3 次，每次5 分鐘，0.3% H₂O₂ 30 分鐘以去除內源性過氧化物，PBS洗3 次每次5 分鐘，加含0.5% Triton X-100 的山羊血清封閉30 分鐘，滴加兔抗GFAP 抗體(1:75)，4℃ 18 小時，PBS洗3 次每次5 分鐘，滴加生物素標記羊抗兔IgG，室溫20 分鐘，PBS洗3 次，每次5 分鐘，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫20 分鐘，PBS洗3 次，每次5 分鐘，DAB顯色。

 五、結果

1. 形態學觀察：光鏡下，傳代的星型膠質細胞折光性強，形狀不規則，主要為多角形，胞體大而扁平、胞質豐富，細胞核圓形或卵圓形，偏于胞體一側，內有1-2 個核仁，有多個粗短枝狀初級胞突，部分細胞突起變細變長，6-7 天后細胞融合成單層，符合神經膠質細胞生長特性，如下圖。
 

星型膠質細胞單層生長(x100)

圖1：星型膠質細胞形成融合狀，單層生長(x200)
 

2.  鑒定：細胞經膠質纖維酸性蛋白(GFAP)染色98%以上均為細胞漿著色，而胞核未見著色，見下圖，證明采用上述方法獲得的細胞為星型膠質細胞，純度高， 可用于實驗。

圖2：免疫組化鑒定，GFAP 染色

3. 細胞生長曲線繪制如下：

圖3：細胞生長曲線