大鼠肝星狀細胞原代培養實驗

SD大鼠

戊巴比妥鈉 小牛血清 DMEM 酶消化液 D-Hanks' 液 酚紅 臺盼蘭 HBSS 氯化鈉 PBS

手術刀 手術剪 尼龍網 相差顯微鏡 熒光顯微鏡

一、實驗材料準備

1.  動物：雄性SD大鼠(體重250-450 g)。
 

2.   試劑：戊巴比妥鈉，小牛血清(或胎牛血清，則更好)，DMEM，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配)，18% Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L，KH₂PO4 0.06 g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO₃ 0.35 g/L，Na₂HPO_4·7H₂O 0.06 g/L或Na₂HPO₄ 0.053 g/L，可加酚紅 0.02 g/L)，HBSS，臺盼蘭等。
 

3.  器械：手術器械，200目尼龍網，相差顯微鏡，熒光顯微鏡。
 

二、原代培養方法
 

1.  大鼠腹腔麻醉后在超凈臺上剖腹，進行門靜脈插管，以D-Hanks'液灌注，同時剪開下腔靜脈，沖掉血液后，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型膠原酶)。

2.  待肝臟變軟后，離體肝臟并剪碎，繼續以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型膠原酶)消化15 min，尼龍網過濾后以450 g 離心5 min(4℃，下同)。

3.  以HBSS重懸沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz液，分置于離心管中，并分別覆以2-3 ml HBSS，1450 g離心16 min后取界面細胞。

4.  以HBSS重懸后再次離心收集細胞，以DMEM重懸后進行細胞計數，并判斷存活率和產量，最后按照常規方法接種(10⁵細胞/cm²)，次日換液，以后每2-3天換液一次。
 

三、傳代方法

棄去培液后以D-Hanks'液洗兩次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，鏡下觀察細胞突起回縮(2-5 min左右)，以完全培液(DMEM+10% NBS)終止反應(若不用EDTA，可以不需離心)，充分吹打后以1:2-1:3接種，然后繼續培養(5%CO₂，37℃)。
 

四、 結果

接種次日，光鏡下可見細胞呈星芒狀，胞質內有脂滴，熒光鏡下328 nm處見自發熒光。附上發表于Biochem Biophys Res Commun 2004年文章的照片(圖1)。

1.  進一步鑒別需要做免疫組化：Desmin和α-SMA；后者在細胞激活后才表達。

2.  采用無須原位消化的方案，完全可行，只不過消化時間更難控制！實驗采用原代培養的或傳代后9代內的細胞(最好5代以內)。

一、參考文獻

1. 袁桃霞，張錦生，張月娥，等. 大鼠肝Ito細胞的體外培養及肝素對其抑制作用的觀察. 上海醫科大學學報 1996;23(2):90-93.
 

2. Huang GC, Zhang JS, Tang QQ. Involvement of C/EBP-α gene in in vitro activation of rat hepatic stellate cells. Biochem Biophys Res Commun 2004;324(4):1309-1318.