如何做好熒光定量PCR實驗？（四）

發布時間：2020-07-20 16:46 原文鏈接：如何做好熒光定量PCR實驗？（四）

3.7 模板濃度

起始模板的量對于獲得高產量很重要。對大多數PCR擴增和熒光PCR擴增，10⁴到10⁶個起始目的分子就足以觀測到好的熒光曲線（或在溴化乙錠染色膠上觀察到）。所需的最佳模板量取決于基因組的大小（下表）。舉例說，100ng到1μg的人類基因組DNA，相當于3×10⁴到3×10⁵個分子，足以檢測到單拷貝基因的PCR產物。質粒DNA比較小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg級的。對于一般的檢測樣品，10－100ng的量就足夠檢測了。當然對模板做一個梯度稀釋，對于定量PCR而言是非常容易，且能分析擴增效率。

表1. 基因組大小和分子數目的比例

基因組 DNA	Size(bp)*	Target Molecules/μg of Genomic DNA	Amount of DNA(μg) for -10^5 Molecules
E. coli	4.7×10^6	1.8×10^8	0.001
Saccharomyces cerevisiae	2.0×10^7	4.5×10^7	0.01
Arabidopsis thaliana	7.0×10^7	1.3×10^7	0.01
Drosophila melanogaster	1.6×10^8	6.6×10^5	0.5
Homo sapiens	2.8×10^9	3.2×10^5	1.0
Xenopus laevis	2.9×10^9	3.1×10^5	1.0
1.0Mus musculus	3.3×10^9	2.7×10^5	1.0
Zea mays	1.5×10^10	6.0×10^4	2.0
pUC 18 plasmid DNA	2.69×10^3	3.4×10^11	1×10^(-6)

3.8 防止殘余（Carry-over）污染

PCR易受污染的影響，因為它是一種敏感的擴增技術。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴增。當前一次擴增產物用來進行新的擴增反應時，會發生共同來源的污染。這稱之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會是污染源（非殘余污染）。

可以在PCR過程中使用良好的實驗步驟減少殘余污染。使用帶濾芯的移液管可以阻止氣霧劑進入eppendorf管內。為PCR樣品配制和擴增后分析設計隔離的區域，在準備新反應前更換手套。總是使用不含有模板的陰性對照檢測污染。

使用預先混合的反應成分，而不是每個反應的每個試劑單獨加入。

一種防止殘余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。這種酶（也稱為尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在擴增過程中將脫氧尿嘧啶替換為胸腺嘧啶使得可以把前面的擴增產物同模板DNA區分開來。因為前面的擴增產物對UDG敏感，所有可以在PCR前對新配制的反應用UDG處理以破壞殘余產物。

4、高產量，特異和靈活的定量PCR試劑體系

影響PCR的因素如此之多，您有時很難區分是什么導致您的實驗結果不佳。降低實驗的不穩定因素是使用優質可靠的產品。

使用優質、性能可靠的熱啟動酶、優質的dNTP、Mg離子、UNG/dUTP防污染系統預混成的定量PCR試劑體系，最大程度的降低了反應變量，提高了實驗的可重復性和可靠性。您還需要進行以下步驟的準備：設計引物和探針、合成引物和探針、正確儲藏、得到高質量的模板，隨后，您僅需要進行退火溫度的優化，就能得到好的實驗結果。

FQ PCR MASTER Mix-UDG（hot start）同競爭對手的定量PCR體系相比提供了更優異的結果。使用這種產品，您可以在您的PCR中得到更好特異性和更高的靈敏度，同時可以靈活地選擇您所喜歡的擴增條件，檢測方法和設備。

實時定量PCR是快速增長的PCR方法，它可以精確、可重復地定量起始物質。FQ PCR MASTER Mix-UDG（hot start）是一種方便使用的反應混合液，為定量分析進行了優化。它包含了熒光PCR所必須的成分（如緩沖液，dNTP，聚合酶）。只需加入您的模板，擴增引物和熒光標記探針。您就可以得到實時qPCR所需的特異性和靈活性。

高產量和特異性的擴增

FQ PCR MASTER Mix-UDG（hot start）提供了強大的PCR擴增，可以使用多個模板組。所使用的Taq DNA聚合酶具有熱啟動特性。這極大地降低和消除了錯誤配對和非特異性擴增，使您得到較高產量，并增加特異性。整合的UDG（尿苷酸DNA糖基化酶）防止殘余污染的能力防止了非模板DNA的擴增，從而降低了假陽性，使結果更可靠。

在產量和靈敏度方面，Quantitative PCR MASTER Mix-UDG（hot start）的靈敏度極高（閾循環）。您可以更精確地定量低拷貝的基因，并在較寬的目的濃度范圍內檢測線性劑量反應。

高度靈活性

除了靈敏度和特異性外，Universal PCR Master Mix Kit在分析設置，檢測方法和設備上給您提供了較高的自由度。使用Universal PCR Master Mix Kit，您可以：

對擴增的不同模板優化鎂離子濃度，由于提供了附加的氯化鎂，所以您可以方便地配置Mix體系。

可以更靈活的進行普通PCR和熒光PCR。

可以在多種設備上使用，如ABI Prism? 7700, ABI GeneAmp? 5700和Bio-Rad的I-Cycler。

可以利用多種檢測方法的優點，包括TaqMan?探針和Molecular Beacon，您不必局限于特定的試劑盒。