如何設計嵌套PCR引物以及注意事項

嵌套 PCR 又稱巢式 PCR（nested PCR,nPCR）,是指以第一次 PCR 產物為模板直接進行第二次 PCR 擴增，以增加 PCR 的靈敏度，第二次 PCR 設計的引物在第一次所用引物對的內部，這種引物被稱為「內部」或 「嵌套」引物。

以第一次 PCR 產物為模板進行第二次 PCR 擴增，可明顯提高敏感度而對特異性無損（Albert and Fenyo 1990)。

由于嵌套 PCR 使用兩套引物對，在補充反應組分如 Tag DNA 聚合酶后就可能提髙總循環數。如果不能進行完整的嵌套 PCR (使用兩個內部引物），為提髙靈敏度和特異性，可設計半嵌套 PCR，即只用一個內部引物，與來自第一次反應的外部引物結合使用。

嵌套 PCR 的最大問題是它易受污染。必須將第一次 PCR 的反應管打開，將初級產物轉移 到新管，以進行第二次反應。其缺點也包括進行兩輪 PCR 需要額外成本和額外進行引物合成。

為了降低污染風險，可使用一種被稱為 drop in/drop out 嵌套 PCR 的單管 PCR 方法。 在該方案中，設計的內部引物的解鏈溫度顯著低于外部引物對。兩對引物都被加于第一次反 應中。在首輪 PCR 過程中，選擇只能使外部引物對退火和延伸的退火溫度。在第二輪擴增 過程中，降低退火溫度，使內部引物對能發揮功能。雖然從污染控制的觀點考慮該法具有吸 引力，但其不能提供最初的嵌套 PCR 方案的所有優勢。

設計策略

PCR 引物設計的一般規律對嵌套 PCR 的引物設計也同樣適用。由于使用多對引物，應考慮到引物之間相互作用的可能性明顯增大。當設計引物用于單管嵌套 PCR 時，比較重要 的一點是內部（被嵌套）引物的解鏈溫度應顯著低于外部（首輪）引物，最簡單的辦法是縮短被嵌套引物的長度（如 18~20 個堿基相對于 25~28 個堿基）。

外部引物對的 Tm 值應足夠髙，以防止內部引物退火，確保在首輪 PCR 中只產生較長的產物。相對于外部引物，應 額外多用內部引物（一般多于 40 倍）。在進行第二輪 PCR 時，選擇較短的退火和延伸時間， 以促進較短的引物退火，提髙較小復制子的產量。