宏基因組二代測序技術在血液病患者感染病原診斷中的應用中國專家共識

　　血液病是原發于造血系統和主要累及造血系統的疾病，這類患者通常免疫功能低下。同時，一些惡性血液病患者需要接受放化療、免疫治療和骨髓移植等治療，使患者進一步處于免疫抑制狀態，因此更易發生感染。血液病患者感染相關臨床癥狀和體征常不典型，感染病原譜廣，傳統微生物學檢測陽性率低、耗時長。因此，病原診斷是優化抗感染治療、改善患者預后的關鍵環節。

　　病原宏基因組二代測序 (mNGS) 是一項覆蓋病原譜廣且高通量的檢測技術，已在臨床感染領域得到了廣泛的應用。在血液病患者感染病原診斷方面，mNGS檢測具有陽性率高、受到抗菌藥物干擾小、覆蓋病原廣的優勢。為優化血液病患者病原mNGS檢測適應證及規范報告解讀，中華醫學會血液學分會抗感染學組特邀請血液學、病原mNGS檢測等領域專家共同制定國內首個針對血液病患者感染病原診斷的專家共識：《宏基因組二代測序技術在血液病患者感染病原診斷中的應用中國專家共識 (2023年版)》。

　　該共識針對血液病患者感染診斷的臨床送檢mNGS適應癥、樣本采集與質量控制以及報告解讀三個方面進行了討論，并形成了16條相關建議，以期為mNGS在血液病患者感染診斷的規范應用提供指導。

血液病患者感染臨床送檢mNGS適應證

　　【共識1】感染是血液病患者常見的并發癥，當疑似感染發生時，應首先選擇傳統微生物學檢測，僅在特殊情境下謹慎選擇病原mNGS檢測

　　1.中性粒細胞缺乏 (粒缺) 伴發熱

　　【共識2】低危且無明顯感染灶的患者，如經抗菌藥物治療≥7d未明顯好轉可考慮在送檢血培養的同時送檢外周血標本mNGS；高危患者初始經驗性治療72～96h無效時，推薦送檢傳統微生物學檢測的同時送檢血液mNGS。

　　2.血流感染 (BSI)

　　【共識3】疑似BSI患者，在留取血培養標本的同時留取血漿樣本，于-80℃暫存；如72h內血培養陰性且抗感染治療無改善的患者，推薦將留存樣本進行mNGS。疑似膿毒癥的重癥患者，建議送檢血培養同時送檢血mNGS。

　　3.下呼吸道感染

　　【共識4】下呼吸道感染患者首選支氣管肺泡灌洗液 (BALF) 送檢傳統微生物學檢測，難以進行支氣管肺泡灌洗的患者，可以選擇深部痰進行檢測，并同時留取標本凍存。如抗感染治療≥72h感染癥狀無好轉或影像學表現持續加重的患者，建議送檢留存標本行mNGS檢測。如為重癥下呼吸道感染或有快速進展為重癥的危險因素患者，建議同時送檢傳統微生物學檢測及mNGS。

　　鑒于血液病患者肺部感染病原譜廣，部分病原難以培養或傳統檢測不能覆蓋，且混合感染常見，推薦對于經驗性抗感染治療無效及重癥下呼吸道感染患者在完善傳統微生物學檢測的同時，采用BALF mNGS進行病原診斷。

　　血液mNGS對于下呼吸道感染病原診斷效果局限。

　　4.中樞神經系統感染 (CNSI)

　　【共識5】疑似CNSI，推薦腦脊液在送檢傳統微生物學檢測的同時送檢mNGS，在流程上建議選擇DNA檢測，僅在考慮RNA病毒感染時完善RNA檢測流程。

　　CNSI時外周血與腦脊液病原分離現象 (腦脊液存在感染病原，而外周血不能檢出) 并不少見。因此，對于疑似CNSI患者，不推薦外周血作為替代樣本進行mNGS檢測。

　　5.腸道或腹腔感染

　　【共識6】疑似腸道感染患者推薦首選傳統微生物學檢測，糞便樣本病原mNGS 檢測可作為補充。疑似腹腔感染，首選感染部位樣本送檢，如不能獲得感染部位樣本可選擇血液樣本送檢，但檢出性能有限，不作為常規推薦。

　　對于腹腔感染，如患者已進展為膿毒癥休克，推薦首選血液樣本mNGS，而相對癥狀較輕的患者可以選擇腹水或血液樣本送檢。

　　6.皮膚軟組織感染

　　【共識7】推薦對累及深部或播散性的皮膚軟組織感染患者，在完善感染部位標本傳統微生物學檢測的同時送檢mNGS，如不能獲得感染灶局部樣本，可選擇外周血。

　　皮膚軟組織是血液病患者感染常見的累及部位，這類感染容易繼發播散，同時也可為播散性感染的表現之一。mNGS對于皮膚軟組織感染的優勢在于陽性率高、覆蓋譜廣及對混合感染的識別能力強。在送檢時，應首選局部樣本，其病原檢出率高于血液樣本。對于播散性感染，在不能獲得局部樣本時可選擇外周血作為替代或根據臨床具體情況選擇感染部位以及血液樣本平行送檢。

　　7.泌尿系統感染

　　【共識8】對于復雜性泌尿系統感染、移植后泌尿系統感染在完善傳統微生物學檢測后不能獲得病原學證據或治療不佳的患者可嘗試尿液mNGS。

　　對于傳統微生物檢測陰性的泌尿系統感染的患者，可嘗試進行尿液mNGS，如感染灶在腎臟，首選穿刺采集組織送檢。

樣本采集與質量控制

　　【共識9】對于病原mNGS檢測樣本，應首選從感染部位直接采集，若無法采集可考慮外周血標本送檢。

　　推薦首選病變部位穿刺或手術采樣，如不能獲得該類樣本，在選擇鄰近部位樣本時應盡量減少正常菌群和定植菌的干擾。在樣本采集后應盡快轉運至實驗室進行檢測，以減少核酸降解。不同樣本采集及注意事項見表1。多種感染類型血液中病原載量均低于感染部位樣本，所以僅推薦血液作為替代樣本送檢。對于無明顯感染灶、感染部位樣本取材困難、經臨床及實驗室評估存在病原和 (或) 核酸入血的情況可進行血液mNGS。mNGS檢測結果依賴于標本質量，標本采集與運輸中應嚴格執行無菌操作與盡快轉運原則。液體樣本一般送檢第二管以減少穿刺部位皮膚定植菌干擾。

報告解讀

　　【共識10】：致病性明確且罕見定植的微生物，低序列檢出也應考慮其為致病菌可能。

　　對于明確為致病菌，尤其是可導致免疫功能健全人群感染的微生物例如結核分枝桿菌、隱球菌、嗜肺軍團菌、鸚鵡熱衣原體、寄生蟲 (血液病患者以弓形蟲最為常見) 等，這些病原不屬于定植菌且致病性明確，在標本中經mNGS檢出應充分考慮其是感染病原的可能性，同時建議進行其他傳統微生物學檢測加以驗證，如PCR、培養、抗原抗體檢測等。不同微生物在不同樣本中的臨床意義見圖2。

　　【共識11】無菌采集獲得的樣本檢出病原，應結合臨床考慮致病微生物的可能，但需注意排除定植。

　　對于外周血、組織、腦脊液、胸腹水及其他穿刺液等正常無菌樣本，mNGS檢出的細菌與真菌應結合當地感染流行病學、患者感染部位及定植情況考慮其是否為致病病原。樣本中單一高序列細菌或真菌檢出往往代表其是致病微生物可能性較高，而對于多種微生物檢出，其解讀應結合檢出病原的常見定植部位及可能的微生物或其核酸的入血途徑進行判斷。例如，腸道或腹腔感染時，腸道黏膜屏障的破壞可引起多種腸道微生物 (或其核酸) 入血，血液mNGS可出現多種微生物檢出的可能，一方面不能除外發生混合病原BSI，另一方面也可能僅為核酸入血。

　　【共識12】外周血樣本mNGS報告中DNA類病毒檢出常見，并非均為感染病原。

　　血液病患者mNGS報告中病毒檢出常見，且往往可有多種病毒檢出，并非均是感染病原，同時，病毒檢出不等同于病毒復制，需結合核酸定量PCR檢測評估其載量。如mNGS陽性但定量PCR陰性，需謹慎判斷為病原的可能。

　　【共識13】非無菌樣本的結果應結合臨床、標本類型、傳統微生物學檢測結果共同判斷。

　　【共識14】耐藥基因的檢出，應在充分考慮基因型與耐藥表型對應性的基礎上進行判斷。

　　不同細菌耐藥基因與表型的一致性差異較大，部分耐藥基因可能存在攜帶而不表達的情況，如銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌染色體攜帶AmpC基因但其未必表達，AmpC基因檢出不等同于耐藥；而部分基因一旦檢出則應高度考慮耐藥的存在，如常見的碳青霉烯類耐藥基因。

　　對于非無菌部位樣本，如痰液、BALF等，多種微生物檢出常見，其耐藥基因的檢出應考慮與病原的對應情況，例如mecA基因的檢出可能出自金黃色葡萄球菌，但也可能來自凝固酶陰性葡萄球菌，需結合病原匹配情況進行解讀。同時，值得注意的是，無耐藥基因型檢出不等于敏感，這往往與檢出病原的序列低導致基因覆蓋度不夠未能檢出耐藥基因有關。

　　【共識15】病原mNGS檢測屬于定性檢測范疇，序列高低不等同于體內病原載量。

　　鑒于目前我國主要使用的病原mNGS檢測手段仍屬于定性檢測水平，序列數高低不等同于病原載量，應審慎應用于療效評價，同時應結合人源背景、測序數據量等綜合評估。此外，對于不同樣本之間因實驗流程、人源比例均存在較大差異，不可直接進行序列數比較來評估療效。

　　【共識16】不推薦將mNGS陰性作為排除感染的標準。

　　盡管mNGS病原檢出率高于傳統微生物學檢測，但仍存在漏檢可能，常見原因主要包括：①標本中人源背景高，微生物核酸比例過低導致未能檢出，例如腦脊液樣本中病毒檢出的靈敏度對標定量PCR 檢測存在漏檢可能；②感染灶隱匿，無游離病原核酸釋放入血，例如肝脾念珠菌病時，病原相對局限；③患者粒缺狀態，病原主要以完整細胞形式存在，血液中無病原游離核酸存在；④感染病原細胞壁較厚，破壁程度不足導致漏檢，例如隱球菌和結核分枝桿菌；⑤標本代表性不足或質量不佳。

 結語

　　對于血液病患者，病原mNGS通過對樣本快速高通量測序，可以獲得更全面、相對無偏倚的病原信息，對感染病原診斷起到積極的作用，尤其對傳統微生物學檢測未覆蓋到或檢測周期較長、陽性率較低的病原可提高檢出率。在臨床應用中，考慮到其目前成本仍相對較高，應對檢測適應證加以規范和限定，其主要應用領域仍然是急、危、重、難的患者感染診治，避免過度使用。對于臨床感染相關樣本應首先完善傳統微生物學檢測，病理、無菌標本培養仍然是感染診斷的金標準，病原mNGS是對傳統微生物學檢測的有力補充和延展而非替代。病原mNGS的報告解讀應充分評估檢出微生物的致病性、流行病學、生物信息學信息，同時在全面結合患者臨床特征的基礎上進行綜合判斷。