qRT-PCR
基因表達分析
在384孔板上11ul/孔的總反應體積中，使用熒光Universal ProbeLibrary（UPL）探針（羅氏公司）和ABI 7900HT 實時儀器（美國應用生物系統公司）以及2X FastStart Universal Probe Master （Rox）PCR試劑（羅氏公司）進行定量RT-PCR。每次反應的 cDNA/RNA濃度為10ng。ABI 7900HT實時儀器（美國應用生物系統公司）的PCR條件如下：+95℃下變性15分鐘，+95℃下擴增15秒，最后在+60℃下延伸60秒。
miRNA定量
使用LightCycler? 480實時熒光PCR儀（羅氏公司）， 在384孔板的模式下，設定反應體積為20ul，以1:10梯度稀釋cDNA，在miRCURY LNA SYBR Green master mix，miRCURY LNA內源性對照SNORD44和miR-21的LNA PCR引物（Exiqon）的共同作用下進行miRNA qRT-PCR. LightCycler? 480儀的PCR條件如下： 95℃變性10分鐘， 95℃變性10秒，60℃延伸20秒，反應設40個循環。使用△△Ct方法（Livak 和Schmittgen，2001年），用HPRT1和GAPDH作為參考（管家基因）基因，來反映假定的靶向基因表達水平上的成倍變化。對于has miR-21，則用非靶向合成類似物-和抑制劑-miRIDIAN作為miRNA轉染HeLa細胞的實驗對照。
3 結果和討論
為了分析miR-21水平升高對靶向基因（PDCE4，PTEN和TLR2）的mRNA水平的影響，我們使用UPL通用探針庫探針（羅氏公司）和ABI 7900HT實時PCR儀（美國應用生物系統公司）對已經報道的能夠被miR-21調控的一些mRNA的豐度進行了定量測定。使用X-tremeGENE siRNA轉染試劑（羅氏公司），用miR-21的類似物和抑制劑對HeLa細胞進行轉染，并分別設置（miRNA 21 miRIDIAN類似物對照，miRNA miRIDIAN類似物對照，miRNA 21抑制劑和miRNA抑制劑對照siRNAs）。miRIDIAN miRNA類似物是一種合成的雙鏈結構，能夠代表對靶向mRNAs進行調控的成熟miRNAs，與內源性miRNAs類似。與之相反，miRIDIAN miRNA抑制劑是一種不可水解的成熟miRNA的反向互補單鏈，在轉染細胞之后能夠降低內源性miRNAs的活性。這極有可能是由于抑制劑與成熟miRNA之間進行不可逆結合造成的（Meister, Landthaler等，2004）。
我們在LightCycler? 480（羅氏公司）上進行qRT-PCR，對miR-21的miRIDIAN類似物和抑制劑對成熟miR-21水平的影響進行了定量測定。使用High Pure miRNA Isolation Kit（羅氏公司）提取miRNA，用qRT-PCR與miRCURY LNA進行定量檢測，并用小分子量非編碼核仁RNA SNORD44進行校準。與用miRIDIAN類似物處理的對照細胞相比較，用50nM miR-21的miRIDIAN類似物轉染細胞后，HeLa細胞中miR-21的濃度上升了7.3倍（見圖3）。與之相反，用50nM miR-21的miRIDIAN抑制劑轉染HeLa細胞后，miR-21水平下降了77%（見圖3）。這表明，X-tremeGENE siRNA轉染試劑（羅氏公司）是一種非常好的轉染工具，能夠有效地將miRIDIAN類似物和miRIDIAN抑制劑轉染到目標細胞中。而且我們還發現，High Pure miRNA Isolation Kit（羅氏公司）能夠有效地提取miRNA，并用于之后miRNA濃度的分析。
在使用miRIDIAN類似物和抑制劑上調和下調細胞內miR-21濃度之后，我們對miR-21公認的靶向mRNAs（PDCD4， PTEN 和TLR2）的表達水平進行了研究。在用miR-21的類似物和抑制劑以及各自的對照物感染HeLa細胞兩天之后，用High Pure RNA Isolation Kit（羅氏公司）提取總RNA。在ABI 7900HT（美國應用生物系統公司）上使用qRT-PCR和UPL通用探針庫探針對mRNA水平進行定量測定，并與對照基因（管家基因）HPRT1和GAPDH正常的基因表達水平進行比較。我們發現，與對照組相比，miR-21的過度表達導致PDCD4（編碼人致瘤性轉化抑制物）的mRNA水平顯著下降了29%（見圖4）。最近的研究發現，mi-R-21過度表達能夠在蛋白質水平和mRNA水平上對PDCD4基因造成影響（Frankel，Christoffersen等人，JBC，2008，283），該實驗的結果進一步證實了這一發現。
與之相反，在PTEN 的mRNA（編碼人同源性磷酸酶-張力蛋白）水平上沒有觀察到miR-21的影響。在上調或下調miR-21水平之后都是這種情況（見圖5）。最近的研究發現miR-21能夠通過影響翻譯過程而在蛋白質水平上對PTEN產生影響，而PTEN mRNA水平則不發生變化（Wickramasinghe 等人，2009，NAR）。我們的研究與這一發現相符。有意思的是，與抑制劑轉染對照細胞相比，在用miR-21抑制劑轉染細胞之后，TLR2（編碼toll樣受體2）mRNA水平顯著下降了57%（見圖6）。miR-21和TLR2都在細胞凋亡調控過程中發揮作用，TLR2可能是miR-21抗細胞凋亡活動的重要介質。TLR2是miR-21活性的直接還是間接靶向基因尚不清楚，仍有待研究。
4 結論
在該研究中，我們分析了hsa miR-21對三個公認的靶向基因（PDCD4，PTEN 和TLR2）在mRNA表達水平上的影響。人miR-21應答通過外源性miRNA miRIDIAN類似物和抑制劑（Dharmacon）進行調控，使用X-tremeGENE siRNA轉染試劑（羅氏公司）能夠輕松實現類似物與抑制劑向HeLa細胞的轉染過程。
為了分析miR21水平，羅氏公司的High Pure miRNA Isolation Kit為之后進行qRT-PCR擴增提供了高質量的模板。該擴增過程用miRCURY LNA First-strand cDNA試劑盒，miRCURY LNA SYBR Green Master Mix，miRCURY LNA內源性對照SNORD44和LNA miR-21 PCR引物（Exiqon），在LightCycler? 480實時熒光PCR儀（羅氏公司）上進行。
為了對假定目標基因進行基因表達分析，我們在工作流程中使用High Pure RNA Isolation Kit（羅氏公司）進行RNA提取，使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（羅氏公司）進行逆轉錄，并用通用探針庫探針UPL和FastStart Universal Probe Master（Rox）試劑（羅氏公司）和ABI 7900HT（美國應用生物系統公司）在調控細胞內miRNA之后對mRNA水平進行定量測定。
綜上，該基因表達分析的工作流程程序易于建立，并且足夠靈敏，能夠檢測到由一般miRNAs引起的mRNA水平的細微變化，適合相關miRNA表達調控研究的參考。
參考文獻
1. Livak, K.J. and Schmittgen, T.D. (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 25, 402-408.
2. Meister, G., Landthaler, M., Dorsett, Y. and Tuschl, T. (2004) Sequence-specific inhibition of microRNA- and siRNA-induced RNA silencing. RNA, 10, 544-550.
3. Frankel, L.B., Christoffersen, N.R., Jacobsen, A., Lindow, M., Krogh, A. and Lund, A.H. (2008) Programmed cell death 4 (PDCD4) is an important functional target of the microRNA miR-21 in breast cancer cells. J Biol Chem, 283, 1026-1033.
4. Wickramasinghe, N.S., Manavalan, T.T., Dougherty, S.M., Riggs, K.A., Li, Y. and Klinge, C.M. (2009) Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acids Res.
X-TREMEGENE，LIGHTCYCLER，HIGH PURE和FASTSTART為羅氏公司商標。
ProbeLibrary和 LNA是丹麥Vedbaek Exiqon A/S公司的注冊商標。
SYBR是分子探針有限公司的注冊商標。
miRIDIAN是Dharmacon公司的商標。
其他商標或產品名稱為其各自所有者的商標。