基因擴增診斷實驗室質量保證涉及整個基因擴增檢測的所有階段,即測定分析前的標本采集處理、測定中的核酸提取、擴增和產物分析以及測定后的結果報告等。
1、污染
(1)污染的來源 在實際工作中,常見有以下幾種污染類型:PCR 片段的污染(產物污染);天然基因組 DNA 的污染;試劑污染(貯存液或工作液)以及交叉污染(如氣溶膠從一個陽性標本擴散到原本陰性的標本)。
對干所有的擴增技術,由于圍繞實驗室來尋找污染源不僅耗時而且還很繁瑣,所以最大的注意力要放在預防上,一旦發生了污染,實驗就必須停止,直到發現了污染源為止。如果沒有例外,實驗結果必須放棄,即使平行的污染質控中僅有一管顯示出有 PCR 片段污染。測定分析階段的污染源。通常,測定分析階段的每一步都可能發生對樣本的污染。反應混合液的任何成分及核酸的制備和反應建立階段所涉及的實驗設備的任何部位都是可能的污染源,如受污染的試劑(例如牛血清白蛋白、明膠或礦物油)、商品酶制劑、消耗品(如反應管、吸頭)和實驗設備(如加樣器、離心機)。
污染的來源之一是許多樣本在同時制備時的交叉污染,但最主要的污染來源為以前擴增產物的特異產物 DNA 片段。
在前面三個工作區中使用的試劑,消耗品或實驗設備的污染可能是由不當的實驗操作所引起的。而在產物分析區,當吸取 PCR 產物用于檢測時非常容易引起污染,因此必須制定并嚴格執行標準操作程序。
(2)污染的避免 要避免污染,首先應是預防而不是排除污染,前面所述工作區的嚴格劃分的目的正是為了預防污染。
為避免以前測定中所擴增產物的污染,可設法將其破壞掉,如在擴增反應中用 DUTP 取代部分 DTTP,從而避免其對將要進行的擴增測定的污染。另外一種方法是持續的長波紫外燈照射,通過異補骨脂素光化學產生 DNA 加合物,由于 DNA 加合物對擴增沒有反應但又不妨礙 PCR 后雜交過程,所以這些方法也能防止污染。
然而,由于上面提到的方法會給人一種假的安全感,所以能以其替代嚴格的實驗室設置和管理,尤其是這些方法不能防止非擴增的天然 DNA 的污染。
(3)去除污染的措施 工作過后必須定期采取有效的去污染措施。
結合各種不同的方法可達到最佳效果,去污染措施包括但不僅限下面幾種:①用100mol/L 次氯酸鈉清潔表面;
②試驗后長時間的紫外照射實驗操作臺和其他表面;
③實驗設備如加樣器的高壓消毒。
2、擴增產物的分析
擴增產物的測定有各種方法,如電泳、限制性酶切、斑點印跡、雜交、測序、分光光度法定量等,但轉基因產品 PCR 測定項目基本上都使用探針雜交方法。
與雜交檢測有關的干擾,雜交結果不充分的原因可能是基因探針不合適,標記方法不對,對探針的標記不夠,雜交或洗滌方法不合適。
常使用的基因探針有:DNA 片段,合成的寡核苷酸和體外的轉錄本(反應 RNA 探針);探針的標記物常用的有生物素,地高辛,熒光素和同位素等。
在擴增后的雜交檢測中,應該嚴格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交條件。溫度太低或離子強度太高都會降低雜交的嚴格性,還會給檢測信號的特異帶來負面影響;相反,提高溫度和/或降低離子強度會增加雜交的嚴格性。因此,嚴密控制溫度和試劑是避免假陽性和假陰性結果的先決條件,要注意的是,溫度和離子強度不能同時改變。