就這樣做輕松搞定實時PCR探針設計

除了為克隆基因、預測編碼蛋白而需要研究基因的構成外，當前在基因組學上的努力也包括對基因組構成的研究，以分析具有結構和調控因子插入的基因。近源物種分析成為比較基因組學的主要內容，被認為是研究進化、基因功能和人類疾病的重要方法。

利用該方法分析微生物，特別是細菌的基因組，早在 1996 年就已開始識別出細菌中的保守基因和與亞種相關的毒性基因（Fredricks and Reiman 1996)。這方面的進展促生了新的、大規模的檢測和識別致病菌的方法。近源種 PCR 可以用來研究進化上相關的種，它們在基因組上有一 些共同的特點，這些保守的區域可被用于在基因組水平識別新種。還可以用該技術在尚未測序的物種的基因組中擴增同源基因。

設計策略

根據多元序列比較和引物設計的一般規律來設計近源種 PCR 引物。通過比較少數幾個大的相近序列識別出保守區域，這些區域即是近源種引物的可能結合位點。近源種的比較需要對少數大的相近序列進行精確比對，通過比對找到保守區，作為可能的近源種引物的設計位點。 引物向保守區的退火可被用于在不同種中擴增同源位點（見圖 1)。應遵循以下步驟。

圖1

1. 利用多重序列比對軟件如 Clustal (http: //www. ebLac.uk/clustalw) 對所選序列進行多重比較。

Clustal 的使用教程，點擊訪問：序列比對之 Clustalx 與 Clustalw 使用指南

2. 推測比對中的保守區域。通過選擇保守序列的每個位置上最常出現的核苷酸，導出 其共同引物。

3. 引物的結合位點應該完全位于保守區域內。對于親緣關系較遠的種，如果序列不是非常保守，可以設計匹配程度較低的探針或引物。引物的 5'端允許有一定的簡并性，但 Y 端的錯配將降低退火的特異性和 PCR 的產量（Sommer and Tautz 1989)。

4. 按照 PCR 引物設計的一般規律，避免近源種 PCR 中引物的錯配和引物二聚體的 形成。

實時 PCR 探針設計

實時 PCR 的應用使得在 PCR 擴增過程中，就能對核酸的起始量進行精確定量，從而不必進行后 PCR 分析。

在實時 PCR 擴增過程中，用熒光指示劑從 PCR 的起始階段就開始對 PCR 監測。 隨著擴增輪數的持續增加，產物逐漸積累，進而報告分子的熒光也就隨之增強。

標記物可以是非特異性的雙鏈 DNA 插入結合染料或序列特異的熒光標記的寡核苷酸探針，寡核苷酸探針用報告熒光染料和猝滅染料標記。

當探針完整時，通過 Forster 共振能量轉移（FRET) 作用，猝火物與報告染料的接近大大減少了后者向空間進行的熒光發射，從而會觀察到 5 '端有報告物、3'端有猝火物的探針有足夠的猝火效應。當探針分子結合進復制子中時，猝火效應被破壞，探針發出熒光。

圖2

對 PCR 的進程進行實時監測的能力使得以 PCR 為基礎的 DNA 和 RNA 定量方法取得突破性進展。通過消除常規定量技術的可變因素的影響，目前已能較可靠地對 PCR 產物進 行定量。由于在外部即可檢測熒光，因此不必在反應結束后打開管蓋，因而防止了氣體浮質 的污染，減少了假陽性結果的數量。

1. 雙標 TaqMan 定量分析 (定量 pcr 探針法引物設計)

一個流行的實時 PCR 探針策略是 TaqMan 分析（Applied Biosystems)，該實驗利用水解探針，它可利用聚合酶的核酸外切酶活性在 PCR 擴增的延伸階段中切開被標記的雜交探針（Holland etal. 1991)。

（1）設計策略

熒光 5'-核酸酶分析是一個方便而完備的過程。探針被設計為與目的序列退火于上下游引物之間。探針的 5' 端用報告熒光染料.(通常為 6-碳氧熒光素 [6-FAM]) 標記，3'端或任意一個 T 堿基位點用猝火染料（6-羧基-四甲基-羅丹明 [TAMRA]) 標記。

圖3

PCR 擴增時，在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針。該探針為一線性的寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團和一個熒光淬滅基團，探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收， PCR 儀檢測不到熒光信號； PCR 擴增時（在延伸階段）， Taq 酶的 5' － 3' 外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與 PCR 產物形成完全同步，這也是定量的基礎所在。

由于報告基團是隨著 PCR 擴增而逐步釋放的，因此整個體系的熒光密度值與擴增的 DNA 量成正比。

當設計 TaqMan 探針時，應考慮以下問題。

（1）探針的 3' 端必須保護以防止其在 PCR 擴增時延伸。可以利用 3'-脫氧腺苷、2', 3'雙脫氧核苷，插人 T 或猝火染料本身封閉 3'端的磷酸基。TAMRA 或另一個猝火物對 3'端 的標記可利用氨基銜接物實現。也可利用氨基銜接物在合成后以寡核苷酸標記。該法適 用于除 Cy3TM、Cy5TM、Cy5.5TM、HEX 和 TET 之外的所有染料。

（2）探針的 Tm 值應當比擴增引物的 Tm 值髙 10℃，在 65~72℃ 之間，因為此時 Tag 核 酸外切酶活性最高。

（3）避免探針的 5' 端結合一個 G 殘基，因之將會在切割后仍猝滅報告物的熒光。

（4）探針中 G 堿基的含量不可多于 C 堿基。

（5）避免單核苷酸重復，特別是 G 殘基。

（6）富含 AT 的序列要增加引物和探針的長度，以達到要求的：Tm 值。注意：探針超過 40bp 時會降低猝火效率和減少產量。

（7）探針退火時應盡可能靠近引物，但不要有重疊部分，與引物的 3'端應至少有一個堿 基的距離。

（8）如果 TaqMan 探針是用來區分等位基因的，建議將錯配的核苷（多態性位點）放在 探針的中間，而不是末端。探針要盡可能短，以通過錯配增加區別能力。

2. 引物和復制子的特性

復制子的大小應該介于 50~150bp, 不應超過 400bp。復制子越短，結果越穩定，因為 這樣可使 PCR 更有效率，更不易受反應條件影響。

3. 商用 TaqMan 探針

如果用 TAMRA 作為猝滅劑，只有 3 種熒光染料，即 FAM、HEX 和 TET 可供選擇作 為報告染料，由于這些熒光報告染料之間光譜重疊，限制了該探針在多元 PCR 中的應用。

如果使用分子信標的通用猝滅劑 dabcyl，就可有較多的熒光報告染料供選擇。dabcyl 可在 TaqMan 探針的 3'端代替 TAMRA, 因此可在探針合成時使用很多種熒光報告劑，從而可在 一個反應中同時監測不同的靶。

4. 用于等位基因鑒別分析的 TaqMan 探針

TaqMan MGB 探針廣泛應用于等位基因的鑒別分析，這些探針有以下特點。

（1） 3'端猝滅劑是非熒光的。因猝滅劑不發熒光，報告染料的熒光可被更精確地測量。

（2）3'端有 DNA 小溝結合物質。小溝結合物質可以增加探針的 Tm 值，因此可以使用較 短的探針。因此，已配對和錯配的 TaqManMGB 探針之間 Tm 值差異較大，可以更精確地 鑒別等位基因。