層析技術:生物化學實驗常用技術(2)

在分配層析中，大多選用多孔物質作為支持物，利用它對極性溶劑的親和力，吸附某種極性溶劑作為固定相；用另一種非極性溶劑作為流動相。如果把待分離的混合物樣品點在多孔支持物上，在層析過程中，非極性溶劑沿支持物流經樣品點時，樣品中的各種混合物便會按分配系數大小流動相而向前移動。當遇到前方的固定相時，溶于流動相的物質又將與固定相進行重新分配，一部分轉入固定相中。因此，隨著流動相的不斷向前移動，樣品中的物質便在流動相和固定相之間進行連續地、動態地分配。這種情形相當于非極性溶劑從極性溶劑中對物質的連續抽提過程。由于各種物質的分配系數不同，分配系數較大的物質留在固定相中較多，在流動相中較少，層析過程中向前移動較慢；相反，分配系數較小的物質進入流動相中較多而留在固定相中較少，層析過程中向前移動就較快。根據這一原理，樣品中的各種物質就能分離開來。分配層析中應用最廣泛的多孔支持物是濾紙，稱紙上分配層析。其次是硅膠、硅藻土、纖維素粉、微孔聚乙烯粉等。
㈡紙上分配層析
紙上分配層析（紙層析）設備簡單、價格低廉，常用于氨基酸、肽類、核苷酸、糖、維生素、有機酸等多種小分子物質的分離、定性和定量。紙層析是以濾紙作為惰性支持物。濾紙纖維與水有較強的親和力，能吸收22％左右的水，而且其中6％～7％的水是以氫鍵形式與纖維素的羥基相結合，在一般條件下較難脫去。而濾紙纖維與有機溶劑的親和力很小，所以紙層析是以濾紙的結合水為固定相，以有機溶劑為流動相。當流動相沿紙經過樣品點時，樣品點上的溶質在水和有機溶劑之間不斷地進行分配，一部分樣品隨流動相向前移動，分配，其中的一部分溶質由流動相又進入水相（固定相）。隨著流動相的不斷流動，各種不同組分按其各自的分配系數，不斷地在流動相和固定相之間進行分配，并沿著流動相向前移動，從而使各種物質得到分離和提純。

離子交換層析

離子交換層析（Ion Exchange Chromatography）是廣泛應用于微生物發酵、醫藥、化工和水質的處理等，分離的對象多為小分子物質。
一、基本原理
離子交換層析是利用離子交換劑對各種離子的親和力不同，借以分離混合物中各種離子的一種層析技術。其主要特點是依靠帶有相反電荷的顆粒之間具有引力的作用。離子交換層析的固定相是載有大量電荷的離子交換劑；流動相是具有一定pH值和一定離子強度的電解質溶液。當混合物溶液中帶有與離子交換劑相反電荷的溶質流經離子交換劑時，后者即對不同溶質進行選擇性吸附。隨后，用帶有與溶質相同電荷的洗脫液進行洗脫，被吸附的溶質可被置換而洗脫下來，從而達到分離混合物中各種帶電荷溶質的目的。離子交換劑按其所帶電荷的性質分為陰離子交換劑和陽離子交換劑兩類。陰離子交換劑本身帶有正電荷，可以吸引并結合混合物[的物質；陽離子交換劑本身帶有負電荷，可以吸引并結合混合物中帶正電荷的物質。
二、離子交換劑的類型
常用的離子交換劑主要有離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換葡聚糖或離子交換瓊脂糖凝膠等。
1．離子交換樹脂：是由苯乙烯作為單體，苯二乙烯作為關聯劑，進行聚合和交聯反應生成的具有三維網狀結構的高聚物。其上再引入所需要的酸性基團或堿性基團。帶酸性基團的屬陽離子交換樹脂；帶堿性基團的屬陰離子交換樹脂。
2．離子交換纖維素：離子交換纖維素對蛋白質和核酸的純化極為有用，因為這生物大分子不能滲入到交聯的結構中，因此不能在一般的樹脂上被分離。而纖維素之所以具有分離、純化高分子量化合物的能力，是因為它具有松散的親水性網狀結構，有較大的表面積，大分子可以自由通過。因此對生物大分子來說，纖維素的交換能力比離子交換樹脂要大，同時纖維素來源于生物材料，洗脫條件溫和，回收率高。離子交換纖維素常用的有兩種，一種是二乙基氨基纖維素，即DEAE－纖維素，屬陰離子交換劑。另一種是羧甲基纖維素，即CM－纖維素，屬陽離子交換劑。
3．離子交換葡聚糖或離子交換瓊脂糖凝膠：這是將離子交換基團連結于交聯葡聚糖或瓊脂糖上而制成的各種交換劑。交聯葡聚糖和瓊脂糖具有三維網狀結構，因此這種交換劑既有離子交換作用，又有分子篩作用。

凝膠層析
凝膠層析又稱凝膠過濾、凝膠色譜、分子篩層析、分子排阻層析等。它是六十年代發展起來的一種快速簡便的分離方法。目前已在生物化學、分子生物學、生物工程學及醫藥學等有關領域中得到應用。