四、基本測定方法
（一）終點法（End point method）
根據反應達到平衡時反應產物的吸收光譜特征及其吸光度大小，對物質進行定量分析的方法。對一般化學反應來說，反應完全（或正、逆反應動態平衡）、反應產物穩定時為反應終點。對抗原一抗體反應來說，是抗原和抗體完全反應、形成zui大且穩定的免疫復合物時為終點。在反應時間進程曲線上為與x軸平行線區段。在測定計算方式上，一般分為一點法和兩點法兩種。
1．一點法（One Point） 以試劑和樣品混合之前的空氣空白（GB）、水空白（WB）或試劑空白（RB）的吸光度值為測定計算基點，以反應終點的吸光度讀數減去空白讀數，得到反應吸光度。通過與相同條件下校準液反應吸光度的比較，求得測定結果。常與一點校準法配合使用，即采用一個校準濃度，校準曲線通過零點且成線性。也應用多點校準。
2．兩點終點法（Two Point End）即終點一始點法 以試劑和樣品混合之后的某一時間點作為始點，以反應終點的吸光度讀數減去始點讀數。一定條件下可降低樣品對反應或反應本身的特異性于擾（主要指色度干擾）。常采用雙試劑，多以加R2前某一點作測定始點；某些情況下，也可以加R2后一點作測定始點。若使用單試劑，主反應啟動太快或儀器起始讀數點受限時難以運用。
固定時間法（Fixed Method）與兩點終點法的區別只是在：測定讀數的末點不在反應平衡區段，而是根據方法學選擇。如血清肌酐（苦味酸法）測定。
3．三點終點法 即雙終點法，在一個通道內一次進行兩項反應相關的終點法測定。比如同測游離脂肪酸和甘油三酯。某些儀器（如HITACHI系列）設置此方法。
（二）連續監測法（Continuous monitoring method）
又稱速率法（Rate Assay）。即連續監測反應過程，根據所測定的產物生成或底物消耗的速度進行定量分析的方法。在反應時間進程曲線上為反應呈恒速區段（斜率保持不變），常用于酶活性線性反應期測定。
1．連續監測法即零級反應速率法，亦稱斜率法。在較長的反應時間區段內（至少90-120秒），每隔一定時間（常為2~30秒）讀取一次吸光度值，至少讀取4點，得到3個△A；一般將連續多次讀數作zui小二乘法處理，讀數間隔時間太短的作帶速率時間（TR）多點法處理，均取線性反應部分的讀數，求出單位時間內的反應速率△A/min。此法必須以零級反應為測定計算的基礎，因為只有在零級反應下，單位時間內的吸光度變化（反應速率△A/min）才與酶活力呈正比。此法相對減少了分析誤差，大大提高了分析速度和準確性。但是，半自動生化分析儀采用單樣品連續監測，相當耗時。應用連續監測法，首先應準備線性范圍內的高、中、低濃度的樣品，分別作反應時間進程曲線，了解不同濃度下反應全過程，兼顧確定延遲時間和線性監測期。
2．兩點速率法即所謂擬一級速率法。在反應中選取兩時問點t 1、t 2，讀取吸光度A 1、A2，計算（A2-A1），（t2-t1）=△A，△t。此方法與終點兩點法的區別主要有兩點：后一讀數點反應未達終點，以速率計算結果。它與連續監測法比較，缺點在于人為確定t 1、t 2，不定因素較多，不能保證反應在t 1-t 2期間呈線性，影響結果準確性；應在常規測定前，先做預試驗來確定線性時間段。若在選擇的時間段內反應不成線性（如零級反應期短，儀器無法設置或測定），則只能改用終點法。優點在于方法簡單；酶活力較低、測定吸光度值較小時，可增加測定時間段而不受儀器連續監測時間點的局限，減少讀數誤差。
3．速率B法在一個通道內一次進行兩項反應相關的速率法測定。它既可以是兩項試驗測定，也可用于干擾或／及樣品空白自動補償0后一用途的原理是：利用儀器的微機自動處理，在*反應（干擾反應）一直維持線性的前提下，可以從第二反應（主反應）速率中扣除*反應速率的延續影響。如用于消除膽紅素轉化為膽綠素吸光度下降、對肌酐苦味酸法測定的負干擾等。某些儀器（如HITACHI系列）設置此方法。
（三）空白（blank）校正
在分光光度法中，常利用空白溶液來調節儀器的吸光度零點，或用來抵消某些測定的干擾因素。在生化分析儀測定中，除了采用雙或多波長、兩點法等排除背景干擾外，常要運用專門空白測定，以便從樣品測定吸光度中扣除其影響。正確選擇空白校正，對提高準確度起重要作用。
1．試劑空白一般在方法類型和校準模式中，即分為有或無試劑空白兩大類。試劑空白單獨測定或與校準配合測定，并需預選裝載去離子水樣品杯或試劑空白架。校準或樣品的各測定點吸光度，均要扣除相應測定點的試劑空白吸光度或空白速率值。無試劑空白的方法，多直接以反應杯的水空白作為測定基準值。
在不少儀器中，試劑空白測定類似校準測定，并非在病人樣品測定時實時測定。所以，要注意它的測定頻率，避免因試劑批號或質量的變化造成試劑空白的改變引起的計算誤差。
2.樣品空白 主要為了消除樣品本身混濁或色度的干擾。常采用空白通道法，測定校正結果=顯色反應通道結果-空白通道結果。多數儀器須另外占用測定通道，分析速度減半，但去干擾的準確性應高于兩點終點。（完）
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