干細胞的鑒定實驗

透 射 電 鏡 樣 品 制 備 技 術

為了滿足透射電鏡觀察的要求，超薄切片必須做到以下幾點：①切片能夠耐受電子 束 的照射，在熱和高真空條件下有一定的穩定性。②細胞的超微結構保存良好，盡量減少人工假象。③ 切 片 厚 度 一 般 在 60?80nm 為 宜 。切片太薄可得到較高的分辨率，但 反 差 弱 ；切片太厚，又會出現結構重疊，分 辨 率 低 ，甚至會出現電子束不能穿透切片以致無法觀察的現象。④要求切片無皺褶、無 刀 痕 、無顫痕和無染色劑污染，并具

它將成為細胞結構的支架，并能承受切片時的各種力的作用。

包埋劑：環氧樹脂包埋劑常溫下為單體，屬于甘油多聚酯類，分子中含環氧基和羥基兩種反應基團，環氧基與胺類 (加速劑) 反應，形成首尾相接的長鏈狀聚合物，而硬化劑 (固化劑) 的酸酐則與羥基結合形成分子間的橫橋連接? 環氧樹脂單體、胺類和酸酐等按一定比例混合，在一定溫度條件下，可形成具有三維空間結構的穩定交聯狀聚合物。常用包埋劑的配制：環氧樹脂 Epon812 是一種淡黃色、低黏度，使用最廣泛的環氧樹脂，它易滲入組織，利于細胞結構的保存。它與硬化劑 D D S A (十二烷基琥珀酸酐)、 M N A (甲基內次甲基鄰苯二甲酸酐) 和加 速 劑 DMP-30[2, 4, 6-三 (二甲氨基甲基) 苯酔] 按一定的比例配制而成，見 表 2.4。

(3) 包埋和聚合方法：將膠囊注滿包埋液，用牙簽移動樣品到膠囊的中心，使組織自然沉落到膠囊的底部。如做定向包埋 (如皮膚、消化道、呼吸道等組織)，取材時應將組織切成長方形，包埋時將所要切片的一端對準包埋模具的尖部進行包埋。包埋后樣品放入聚合器內，聚合溫度及時間為： 35℃ ， 12 h ; 4 5℃ ， 12 h ; 60℃， 24 h 。

半 薄 切 片

為了在電鏡下最后確定感興趣的組織的位置，』獲得在光鏡下檢查的半薄組織切片是很有必要的。

修塊

將包埋塊修成與頂面呈 45。斜面的錐體形。頂端是切片面，修成梯形、正方形或長方形。

切半薄切片

用 超 薄 切 片 機 切 下 的 切 片 ，滴一滴蒸餾水在涂有血清的載物片上，將切片浮在蒸餾水滴上，在 70——80 ℃電熱板上烤干后，再進行蘇木素-伊紅 (HE) 染色。

超 薄 切 片

載網及支持膜

(1) 載 網 ：超薄切片需放置到銅、鎳 、金等材料制成的載網上，經染色后才能在電鏡下觀 察 。 載 網 的 直 徑 為 3m m ，孔 數 有 50、 100、 2 0 0 和 4 0 0 目。最 常 用 的 是 200目載網。

(2) 支持膜：在載網上鋪覆一層薄膜是為了增加切片對電子轟擊的耐受強度。

支持膜的制備方法：支 持 膜 是 用 0.4% 火棉膠-醋酸戊脂溶液或 0.1%? 0.2% 聚乙烯醇縮甲醛膜 (formvar 膜) 氯仿溶液制備而成。先將干凈載玻片浸人上述液體中，提出載玻片并使之直立于濾紙上，待干后即在載玻片上形成一層薄膜。用小刀或鑷子尖劃斷膜的四邊 ，將載玻片插入雙蒸水中，使薄膜與載玻片剝離而漂浮于水面上。再將洗干凈的銅網凸面貼膜，排列于膜上。最后用干凈載玻片撈起支持膜及銅網，干燥備用。

超薄切片

(1) 超薄切片機：現市場上有國產及進口的不同牌號的切片機，就其推進原理可分為熱膨脹式和機械式兩種類型。不同型號的超薄切片機操作方法不同，使用者應按儀器操作手冊進行操作。

(2) 切 片 刀 ：切片刀分有玻璃刀和鉆石刀兩種。大多數是使用一次性的玻璃刀。鉆石刀價格昂貴，適合用于硬度高的樣品。

(3) 超薄切片厚度： 60——70n m 。

(4) 撈 片 ：用眉毛針把切片集中，然后用鉑金絲圈將它撈出，放置于載網中央。

超 薄 切 片 的 染 色

指染色劑 (一般為重金屬鹽) 與細胞的某些成分結合或吸附，從而增加其散射電子的能力。不同部位對重金屬鹽離子的吸附能力不同，吸附重金屬能力強的區域，散射電子的能力就強，表現為暗區，反之為亮區。

醋酸雙氧鈾-檸椽酸鉛染色法

(1) 醋酸鈾：又稱醋酸雙氧鈾。能與細胞內大多數成分結合，主要是提高核酸、核蛋白和結締組織纖維成分的反差，也能對糖原、分泌顆粒和溶酶體染色，但對膜結構染色效果差。

醋酸鈾染液：使用棕色試劑瓶配制染液，醋酸雙氧鈾 2 g 加 5 0 % 乙 醇 IOOml，充分攪拌 lOmin，靜 置 1? 2 天后取其上清液或過濾后取其過濾液。醋酸鈾具有一定的放射性及化學毒性，遇光易分解，應密封避光冷保存。

(2) 檸檬酸鉛：鉛的電子密度很高，對細胞的微細結構有廣泛的親和力，能提高細胞膜系統、脂類和糖原顆粒的反差。檸檬酸鉛具有一定的毒性。

檸檬酸鉛染色液：
硝酸鉛 Pb(N O 3)2 l.33 g
檸檬酸鈉 Na(C6H5O2).H2O 1.76 g
雙蒸水 30 ml

將上述成分放入 50m l 容量瓶中，用力振蕩 30 min，至溶液呈乳白色混濁狀后，加入lmol/L N a O H 8m l ，使溶液變為清亮透明，再加 雙 蒸 水 至 50m l ，染 液 p i m . O , 置 4 ℃ 冰箱保存。

2 ) 娃膠板染色法

硅膠板染色器具：小玻璃試管 2 支 ，同時每根試管各配一個橡皮塞子；硅 橡 膠 板 1 塊 ：用雙面刀片在板上劃兩排共 36 條劃縫 (圖 2.1)。

染色方法：
(1) 左手持桂橡膠板，用中指從板背面輕輕頂起，使板上的劃縫張開，右手用鑷子將銅網插入劃縫內，直到插完最后一張切片。

(2) 將硅橡膠板插入試管內，加入鈾染色液 ，蓋好橡皮塞子，染 色 15——20 min。

(3) 用鑷子將硅橡膠板從試管內取出，用蒸餾水沖洗 20 min，再用濾紙將水吸干。

4) 用同樣的方法將硅橡膠板插入到另一根試管內，加 入 鉛 染 液 ，蓋好橡皮塞子,染 色 5——7m in ， 取 出 板 用 蒸 餾 水 沖 洗 20m in ， 用濾紙將水吸干， 自然干燥后即可電鏡觀察。

注意：①鉛染液最好使用 99.99% 的高純度的硝酸鉛配制，因為其染色效果好并且不易污染切片。②由于醋酸鈾和檸檬酸鉛染液具有放射性和毒性，因此操作時要注意防護。

特 殊 樣 品 的 制 備

1 ) 血細胞、骨髓細胞

抽靜脈血 (抽骨髓)3——4m l ，放入含有肝素抗凝劑的離心管內搖勻，以 800——1000r/min的 速 度 離 心 8? lOmin，血液可分為血漿 (上層)、白細胞 (白色中層) 和紅細胞 (紅色下層) 三層 。用吸管沿管壁輕輕地將血漿吸掉，露出白細胞層，沿壁緩慢加人 2.5% 的戊二酵，4℃固 定 lh。取出透明層，切 成 l m m x l m m x 2m m 長方塊，再用戊二醛固定 1h。其他步驟按常規樣品制備。

2 ) 培養細胞樣品

由于培養細胞小、數量少以及培養方式的多樣化，使得完全按照同一個方法制備樣品已不能滿足培養細胞電鏡觀察的要求。應根據觀察目的選擇合適的細胞培養方式，再采用不同的制樣方法。

(1) 根據觀察目的的不同，歸納了 4 種不同的細胞培養方式：①觀察細胞一般形態的超微結構，細胞應在培養瓶 (玻璃或塑料) 或培養皿 (玻璃或塑料) 內培養，細胞呈貼壁式或懸浮式生長；②觀察細胞和細胞間的連接結構，細胞應在載玻片、可拆卸的 9 6 孔培養板中或濾膜 (millipore 0.45p m pore) 上培養；③觀察原位特定細胞 (如觀察某個培養細胞的
分裂像)，細胞應在 35m m 塑料培養皿中或 6 孔培養板內培養；④觀察組織工程中培養在膠原內的新生細胞。

(2) 根據不同的細胞培養方式，選擇不同的樣品制備方法。

a. 培養瓶內細胞的樣品制備方法：游離的培養細胞以 800? 100 〇 r/m i n 的轉速離心IOmin，細胞沉在離心管底部，1.5 h 。其他步驟按常規制樣方法進行。貼 壁 細 胞 ：用硅膠刮將細胞刮下來，切忌使用刀片刮，離心后按上述方法制備。

b . 原位包埋法：①細胞長在載玻片上：將細胞連同載玻片一起固定、脫水和浸透 。細胞面朝上與液體直接接觸。在光鏡下先選好要觀察的細胞區域然后再包 埋 。②細胞在可拆卸的用吸管吸去培養液，加人戊二醛固定液 4 ^ 固定 96 孔板內培養：樣品制備在板內進行，固定、脫水、浸透和包埋均按上述方法
操作，聚合后用錘子砸碎塑料外殼，取出樣品塊，修塊后可直接切片。③原位
特定細胞培養在 35 mm 塑料培養皿或 6 孔板中：同②制備方法一樣，在培養皿內進行固定、脫水、浸透、包埋和聚合，在光鏡下定位觀察細胞，經修塊后再切超薄切片。④細胞長在濾膜或膠原上：將濾膜或膠原視為一個組織塊，按上述制備方法進行固定、脫水和浸透，最后用定向平板包埋板包埋 (圖 2.2)