分子和原子一樣，也有它的特征分子能級，分子內部的運動可分為價電子運動、分子內原子在平衡位置附近的振動和分子繞其重心的轉動。因此分子具有電子能級、振動能級和轉動能級。
分子從外界吸收能量后，就能引起分子能級的躍遷，即從基態躍遷到激發態，分子吸收能量同樣具有量子化的特征，即分子只能吸收等于二個能級之差的能量，符合：⊿E＝E2－E1＝hν=hc/λ
由于三種能級躍遷所需能量不同，所以需要不同波長的電磁輻射使它們躍遷，即在不同的光學區域出現吸收或發射譜帶。
某些物質的分子吸收一定能量后，電子從基態躍遷到激發態，以光輻射的形式從激發態回到基態，這種現象稱為分子發光，在此基礎上建立起來的分析方法為分子發光分析法。
根據分子受激時所吸收能源及輻射光的機理不同分為：
光致發光：以光來激發而發光有分子熒光分析法和分總磷光分析法。
電致發光：以電能來激發而發光
生物發光：以生物體釋放的能量激發而發光
化學發光：以化學反應能激發而發光—化學發光分析法
分子發光光譜原理
分子在一定的能量輻射下，也會從低能級躍遷到高能級，當激發態分子以輻射躍遷形式釋放能量，然后返回到較低能級或基態時，便產生分子發光，依據激發的模式不同，分子發光包括光致發光（熒光或磷光）、熱至發光、場致發光和化學發光等。
處于激發態的電子，通常以輻射躍遷方式（熒光和磷光）或無輻射躍遷方式再回到較低能級的激發態或基態。無輻射躍遷：則是指以熱的形式輻射其多余的能量。
各種躍遷方式發生的可能性及程度，與熒光物質本身的結構及激發時的物理和化學環境等因素有關。
分子熒光發射
處于第一激發單重態中的電子以輻射躍遷返回至基態各振動能級時，就產生了分子熒光。
由于激發態中存在有振動馳豫和內轉化現象，使得熒光的光子能量比其受激發所吸收的光子能量低，因此熒光波長λ3較激發波長λ1或λ2都長。
注意：
不論電子開始被激發至什么高能級，最終將只發射出波長為λ3的熒光。熒光的產生在10-7-10-9s內完成。
分子磷光發射
電子由基態單重態激發至第一激發三重態的幾率很小，因為這是禁阻躍遷。但是，由第一激發單重態的最低振動能級，有可能以系間竄躍方式轉至第一激發三重態，再經過振動馳豫，轉至其最低振動能級，由此激發態躍回至基態時，便發射磷光，這個躍遷過程（T1→S0）也是自旋禁阻的，其發光速率較慢，約為10-4-10s。因此，這種躍遷所發射的光，在光照停止后，仍可持續一段時間。
熒光與磷光的比較
1.熒光是由激發單重態最低振動能級至基態各振動能級間躍遷產生；
磷光是由激發三重態的最低振動能級至基態各振動能級間躍遷產生的。
2.激發單重態的平均壽命大約為10-8s，熒光產生快，而激發三重態的平均壽命為10-3-10s，磷光產生稍慢。磷光壽命比熒光廠。
3.磷光輻射的波長比熒光長。
4.無論電子開始被激發至什么高能級，熒光和磷光的波長都是固定的。
激發光譜曲線和熒光、磷光光譜曲線
熒光和磷光均為光致發光，因此必須選擇合適的激發光波長，可根據它們的激發光譜曲線來確定。
繪制激發光譜曲線時，固定測量波長為熒光（或磷光）最大發射波長，然后改變激發波長，根據所測得的熒光（磷光）強度與激發光波長的關系，即可繪制激發光譜曲線。
注意：
激發光譜曲線與其吸收曲線可能相同，但激發光譜曲線是熒光強度與波長的關系曲線，
吸收曲線則是吸光度與波長的關系曲線，兩者在性質上是不同的。當然，在激發光譜曲線的最大波長處，處于激發態的分子數目是最多的，這可說明所吸收的光能量也是最多的，自然能產生最強的熒光。
繪制熒光或磷光光譜曲線：固定激發光波長為其最大激發波長，然后測定不同的波長時所發射的熒光或磷光強度即可。
在熒光和磷光的產生過程中，由于存在各種形式的無輻射躍遷，損失能量，所以它們的最大發射波長都向長波方向移動，以磷光波長的移動最多，而且它的強度也相對較弱。
熒光和分子結構的關系
分子產生熒光必須具備兩個條件：
① 分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應的結構，才能吸收激發光；
②吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產率。
熒光發射光譜的普遍特性
1.Stokes位移
分子的熒光光譜的波長總是比激發光譜的波長要長，這種波長位移的現象稱為Stokes位移。
2.熒光發射光譜的形狀與激發波長無關
3.鏡像規則，通常熒光發射光譜和它的吸收光譜呈鏡像對稱關系。
溶液熒光猝滅
熒光物質分子與溶劑分子或其它溶質分子的相互作用引起熒光強度降低的現象稱為熒光猝滅。能引起熒光強度降低的物質稱為猝滅劑。
1.碰撞猝滅
2.靜態猝滅（組成化合物的猝滅）
3.轉入三重態的猝滅
4.發生電子轉移反應的猝滅
5.熒光物質的自猝滅
不論是哪種猝滅，增大熒光物質的濃度均會使熒光猝滅效應增強，從而導致標準曲線向濃度軸彎曲，即使熒光強度降低。
著名的熄滅劑:
① 鹵素離子
② 重金屬離子
③ 氧分子
④ 硝基化合物
影響熒光強度的因素
1.溶劑
溶劑的影響可分為一般溶劑效應和特殊溶劑效應。
2.溫度
低溫下測定，提高靈敏度。
3.溶液pH值
大多數含有酸性或堿性基團的芳香族化合物的熒光性質受溶液pH的影響很大。
共軛酸堿對是具有不同熒光性質的兩種型體，具有各自的熒光效率和熒光波長。
4.內濾光作用和自吸收現象
溶液中若存在能吸收激發或熒光光能的物質，就會使熒光減弱，這種現象稱為“內濾光作用”。在溶液濃度較大時，一部分熒光發射被自身吸收，產生“自吸收”現象而降低了溶液的熒光強度。
熒光分析儀
1.光源
2.兩個單色器 (用于選擇激發光波長和熒光波長)
3.液槽
4.檢測器
5.信號顯示記錄器
由光源發射的光經第一單色器得到所需的激發光波長，通過樣品池后，一部分光能被熒光物質所吸收，熒光物質被激發后，發射熒光。為了消除入射光和散射光的影響，熒光的測量通常在與激發光成直角的方向上進行。
為消除可能共存的其它光線的干擾，如由激發所產生的反射光、Raman光,以及為將溶液中雜質濾去，以獲得所需的熒光，在樣品池和檢測器之間設置了第二單色器。熒光作用于檢測器上，得到響應的電信號。
分子熒光分析法的特點
1. 靈敏度高
熒光強度隨激發光強度增強而增強（提高激發光強度，可提高熒光強度）。
采用高靈敏度的檢測系統可大大提高靈敏度，熒光分析法的檢測限比分光光度法低2~4個數量級。
2. 選擇性好
不同的物質用不同的光進行激發，選擇不同的激發光波長。
不同的物質發射的熒光不同，選擇不同的檢測熒光波長。
比較容易排除其它物質的干擾，選擇性好。
3. 實驗方法簡單
4. 待測樣品用量少；儀器價格適中。
發光強度可定量測定許多痕量的無機物和有機物，廣泛應用在生物化學、分子生物學、免疫學及農牧產品分析、衛生檢疫等領域。
熒光法比磷光法應用廣泛，不如分光光度法。
局限性：主要是因為能發熒光的物質不具普遍性、增強熒光的方法有限、外界環境對熒光量子效率影響大、干擾測量的因素較多。
熒光分析法的應用
1.定量分析
（1）標準曲線法——最常用的定量分析方法。
（2）熒光猝滅法
（3）比較法
2.無機化合物的分析
無機化合物中，能直接產生熒光并應用于測定的為數不多，但與有機化合物生成發熒光的有機配合物后，進行熒光分析的元素達70多種，其中較常采用熒光法測定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd及某些稀土元素。
3.有機化合物的分析
脂肪族有機化合物的分子結構較為簡單，本身能發熒光的很少，一般需要與某些試劑反應后才能進行熒光分析。
芳香族化合物因具有共軛的不飽和體系，多數能發熒光；可直接用熒光法測定。對于具有致癌活性的多環芳烴——熒光分析法是最主要的測定方法。
為提高測定的靈敏度，有時也將芳香族化合物與適當試劑反應之后進行測定。
可測定結構復雜的大量有機物質，如：各種維生素、葉綠素、氨基酸、蛋白質、酶和輔酶
以及各種藥物、毒物和農藥等。
磷光分析法的應用
能產生磷光的物質數量很少，磷光分析不及熒光分析普遍，但磷光分析法已在藥物分析、臨床及環境分析領域得到一定的應用。
低溫磷光分析已應用在萘、蒽、菲、芘、苯并芘等多環芳烴及含O、S、N的雜環化合物分析。
固體表面室溫磷光分析法已成為多環芳烴和雜環化合物的快速、靈敏的分析手段。
