幽門螺桿菌研究進展

幽門螺桿菌研究進展

幽門螺桿菌及其感染

　　1 概述

　　胃細菌學的研究，長期來是一個被忽視的領域。1983年Marshall和Warren從慢性活動性胃炎患者胃粘膜活檢標本中分離到幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp）是對這一領域重要的突破。

此后不久即在國際消化病學界引起了巨大轟動，它的發現對消化病學、特別是胃十二指腸病學的發展起了極大的推動作用。現在已經清楚它是許多慢性胃病（慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等）發生發展中一個重要致病因子。

　　1.1 Hp的歷史、發現和命名

　　1.1.1 歷史背景

　　Marshall在分離到Hp后又回過來探索了歷史上的文獻，發現這一類細菌實際上早就已經被人注意過。1893年在狗中，1896年在大鼠和貓中已有人報告在其胃中偶然見到螺形菌。本世紀初在潰瘍性胃癌病人胃內容物中曾找到同樣的細菌。

其他報告也證實了這一些發現。也注意到健康人中未發現這些細菌。經過30年的努力，在散載的報告中，良性消化性潰瘍病人胃中發現了這些細菌。1938年Doenges在一份綜合性尸解研究報告中提出胃中螺形菌的流行率達43％，但是并未檢查出這一細菌與不同的胃部疾病之間的關系。

　　關于這些細菌在人胃疾病中可能的作用一直存在著爭論。有些研究者提出人們在活檢標本中所見到的這種細菌是經口吞服的污染物。這一假說1959年由于當時的一位有影響的學者palmer發表了1000例胃活檢標本大量組織學研究的報告而占了優勢。在此以后對胃的細菌學的興趣被潑了一盆冷水。

　　1975年Steer和Colin-Jones報告了胃潰瘍病人中胃粘液層下的胃粘膜上發現了細菌，重新引起了人們對胃細菌在消化性潰瘍致病機制中作用的興趣，這提示細菌可能降低胃粘膜的抵抗力，因此易感于潰瘍。Steer等企圖分離這一細菌。

結果生長的是綠膿桿菌。后來仔細審閱文章中的圖片提示在粘膜中所見的是一種與綠膿桿菌無關的螺形菌。現在看來這些作者分離到的綠膿性桿菌可能是來自內窺鏡的污染菌，而圖片中所見的才是我們現在大家感興趣的Hp。

　　現在已知Hp能產生大量尿素酶，在發現Hp之前許多學者曾證明在許多種動物胃中有內源性尿素酶活性的存在。1924年Luck和Seth最早描述了這一活性。1955年Kornber和Devies在一篇綜述中下結論認為胃尿素酶主要存在于胃體部，且來源于細菌。后來在人糞中的研究還證實了這些酶與潰瘍病之間的關系，甚至有人用尿素治療某些病人取得了療效。

　　隨著Hp的發現，人們現在可以把這些研究放在一起得到一個清晰的認識，把胃中的Hp與尿素酶聯系起來了。在這整個過程中從胃粘膜活檢標本中分離Hp是一個關鍵因素。沒有這一發現，人們對胃病的認識仍將受到限制。

　　1.1.2 發現和命名

　　在上述歷史背景以及胃鏡檢查已大大普及、分離培養空腸彎曲菌的微需O2方法已經成熟的條件下，Marshall等敏感地意識到胃中所見的螺形菌，形態上與糞便中分離到的空腸彎曲菌相似。既然用常規的需O2和厭O2方法都不能把它分離出來，何不用分離培養空腸彎曲菌的方法試一試呢？結果因此使他們獲得了成功。

國內是在1985年取得成功的。最初信憑它形態上與彎曲菌屬細菌相似，分離培養方法也相似，只是從胃標本中分離到的，因此稱作胃彎曲菌樣細菌（gastric campylobacter like organism,GCLO）。

不久，由于此菌在胃竇部多見，又改稱作幽門彎曲菌(campylobacter pyloridis,CP)，后來又因為這一名稱不符合細菌統一的拉丁文命名原則，又改為cacpylobater pylori，簡寫與中文譯名未變。

隨著對這一細菌的生物學性狀研究的不斷深入，發現這一細菌雖在形態和培養特性上與彎曲菌屬細菌有相似之處，但也有許多特性與彎曲菌屬細菌明顯不同。曾有人根據Hp的16SrRNA的核苷酸序列與彎曲菌屬細菌不同，而與wolinella succinogenes相近，提出應歸入wolinella屬。

1989年Goodwin等把CP與彎曲菌屬與wolinella屬的代表菌種從超微結構、脂肪酸組成、呼吸醌、生長特點、酶的活性等五種表現型特征上作了系統的比較。他們認為CP既不應屬于彎曲菌屬，亦不歸Wollinella屬，應另立一個新屬，稱作螺桿菌屬（helicobacter,H）。

因之，CP應相應改稱為幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)。而當時已從雪貂胃中分離到的類似Hp的一種campylobacter mustelae相應改為雪貂螺桿菌（helicobacter mustelae,Hm）。

自從新立螺桿菌屬以來，國際上已先后有人從多種動物胃腸道分離到新的菌種認為是屬于螺桿菌屬的，亦有人從過去已歸屬于彎曲菌等屬的細菌中拉出某些細菌來認為應歸于螺桿菌。從現有報道看，螺桿菌屬的細菌已不下10余種。其中，除了Hp和Hm以外，還有一種貓螺桿菌（helicobacter felis,Hf）亦已得到較多人的認同以外，其他的尚均還在被認同之中。

　　1.2 Hp感染與上消化道疾病的關系

　　Hp感染與上消化道疾病之間的高度相關性已有大量報道，且已取得了基本一致的認識如下。

　　1.2.1 Hp感染與慢性胃炎

　　Hp與慢性淺表性胃炎之間的病因關系已充分確立。其證據如下：①事實上所有Hp陽性者都證實有胃竇炎。②若Hp感染經抗菌治療，Hp根除后，胃炎可消退。③在一些動物模型中，接種由患者胃中分離而得到的Hp后，可復制出慢性淺表性胃炎的病損。④Marshall和Morris，分別用患者的Hp對自己作了自身感染，亦取得了同樣結果。

　　1.2.2 Hp感染與消化性潰瘍

　　從現有資料要確立Hp與消化性潰瘍（peptic ulcer diseases,PUD），包括胃潰瘍、十二指腸潰瘍之間的病因關系尚有困難。部分原因是缺乏合適的動物模型，而且在Hp感染者中僅有少數人發生潰瘍。然而幾乎所有PUD患者都有Hp感染性胃炎。

因此，在沒有其他促發因素，如服用甾體類抗炎藥（NSAID）或有Zollinger-Ellison綜合征存在時，Hp感染與胃潰瘍之間的相關性稍弱，不是NSAID誘發的胃潰瘍患者中，80％有Hp感染。然而重要的是要注意到Hp感染者中的大多數人并不發生十二指腸或胃潰瘍。

這些事實意味著宿主的遺傳性特征，菌株的變異性或其他因子在其中起著作用。Hp感染根除后，潰瘍病復發率顯著降低，這是Hp在PUD中起病因作用的最有力的證據。Hp根除后可預防潰瘍病復發，這在胃潰瘍中證據不如十二指腸潰瘍那樣充分。

在十二指腸潰瘍病例中，奇怪的是有些研究中，Hp在胃竇部部位比發生潰瘍的十二指腸部位更為常見。胃竇部位的Hp為什么會引起十二指腸病變？已經提出的機理包括：Hp在十二指腸胃化的細胞上定居，胃酸或十二指腸碳酸氫鹽的繼發性改變，或感染菌的產物和／或宿主炎癥應答反應引起的病變。

　　1.2.3 Hp感染與非潰瘍性消化不良

　　Hp感染與非潰瘍性消化不良(Nonulcer Dyspepsia，NUD)的相關性尚缺乏令人信服的證據。因此尚存在著爭論。NUD患者中Hp的感染率并不高于一般人群。

　　1.2.4 Hp感染與胃部惡性腫瘤

　　Hp感染與胃腺癌：胃腺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一。在我國發病率僅次于肺癌。有證據顯示Hp感染與胃體和胃竇腺癌相關聯。然而，胃癌亦發生于一些無Hp感染證據的人。Hp感染的預防和治療對胃癌發生的危險性的影響，證據尚不夠充分。流行病學資料表明：胃癌發生率在一些Hp感染率高的人群中較高。Hp感染率和胃癌發生率都與社會經濟狀態呈負相關，都隨著年齡增加而升高。

在發達國家的連續出生列隊研究中已見下降。在美國，非洲裔美國人和拉丁美洲人的發生率高于白種人。已發現，Hp感染率與胃癌死亡率之間存在著地區分布性的相關。然而，這兩種病在流行病學上存在一些明顯不一致的情況。例如，胃癌男人比女人高發，而Hp感染率兩性間并無差別。

據報道，某些人群Hp感染率高，但胃癌發生率低。這些不一致表明：除Hp感染率外其他因素在胃癌危險因素中亦很重要。在有一些但不是全部回顧性血清學研究中表明，胃癌患者的Hp感染率比對照組高。

　　感染與胃癌有關的最有力的證據來自三個前瞻性列隊血清學研究。這些研究表明Hp感染者的胃癌發生率顯著增加。在這些研究中，均未見Hp感染與賁門癌和胃食管聯結處癌有關聯。

　　Hp感染與淋巴瘤：胃的非何杰金淋巴瘤是一種罕見的病，占胃惡性腫瘤的3％。粘膜相關淋巴組織性淋巴瘤（MALT）低度克隆的新生物，被認為起源于固有膜中的淋巴樣聚合（Lymphoid aggregate）。初步的流行病學資料顯示，Hp感染與胃非何杰金淋巴瘤和MALT淋巴瘤都相關。

　　如果Hp感染與胃癌之間有任何病因關系，那么顯然別的因素在胃癌的發生率中亦有重要作用。因此，目前尚不提倡出于預防胃癌的目的而作根除Hp的治療。

　　2 Hp的生物學性狀

　　2.1 Hp的形態學特征

　　Hp的形態學已有了充分的描述。總之，它是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓、螺旋形彎曲的細菌。長2.5～4.0μm，寬0.5～1.0μm。革蘭染色陰性。有動力。在胃粘膜上皮細胞表面常呈典型的螺旋狀或弧形。在固體培養基上生長時，除典型的形態外，有時可出現桿狀或圓球狀。

　　電鏡下，菌體的一端可伸出2～6條帶鞘的鞭毛。在分裂時，兩端均可見鞭毛。鞭毛長約為菌體1～1.5倍。粗約為30nm。鞭毛的頂端有時可見一球狀物，實為鞘的延伸物。每一鞭毛根部均可見一個圓球狀根基伸入菌體頂端細胞壁內側。在其內側尚有一電子密度降低區域。鞭毛在運動中起推進器作用，在定居過程中起拋錨作用。

　　Hp經鞣酸處理，發現其外表面被厚達40mm的糖萼（glycoculyx）所包裹。電鏡下，由于其呈細絲網狀，與胃上皮細胞表面連接，因此亦有人稱之為纖毛或擬菌毛。

它成為Hp粘附于胃上皮細胞表面的主要物質基礎。Hp定居于胃上皮細胞表面，除了鞭毛和糖萼的作用以外，在電鏡下，尚可見到菌體細胞壁與胃上皮細胞細胞膜表面直接相貼的現象。這種現象的機理可能與藉糖萼粘連的機理不一樣。其本質及其有何特殊意義有待研究。

細胞表面超薄切片透射電鏡（×70000）

Hp:幽門螺桿菌

Ep:胃上皮細胞

超薄切片透射電鏡（×60000）

Hp：幽門螺桿菌

Ep：胃上皮細胞

　　培養物中的Hp，用懸滴法作電鏡觀察時，常見菌體外圍有“炸面圈樣”或“指突狀”結構包裹。這些結構有何含義亦不清楚。

　　延長培養時間，典型的細菌會發生圓球樣形態的變化。這可能就屬于Hp的L型。它亦可在暴露于大氣（含O2量較高）時發生。這種圓球體（圖6）有兩種類型。一種較大，電鏡下可見稀疏的細胞質，細胞體積膨大。這種類型可能是一種退化型，在傳代中不能再生長。

另一種小圓球體，電鏡下可見電子密度較高的細胞質，且有完整的細胞膜。這種類型可能比前者有較高含量的KDO和蛋白質。它已經被證明至少在30d內對物理和化學因素有一定的耐受性。且在4周～6周內在合適的培養條件下能重新生長成繁殖體。可是迄今尚未能證實這種圓球體在自然環境中的持續存在。或許這是弄清Hp感染的流行病學和某些治療中失敗的原因的關鍵因素。

　　2.2 Hp的生理學特征

　　2.2.1 Hp的生長和生存條件

　　Hp是一種專性微需O2菌。它的穩定生長需要依靠在生長的微環境中含2％～8％O2。因此，它在大氣中和絕對厭O2條件下均不能生長。從臨床標本中分離野生株都必需補充適量的CO2。

早期認為Hp并不在代謝中利用碳水化合物獲得能量，而是利用有機酸和氨基酸。但是不久前Reymolds等研制了一種合成培養基證明精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸是Hp的必需氨本酸。有一些株尚需要丙氨酸或絲氨酸。

但沒有葡萄糖時，Hp仍不能生長。有適量葡萄糖和丙氨酸時能大大促進其生長。這說明葡萄糖可能仍然是Hp能量和碳源的重要來源之一。Hp只含有MK－6呼吸醌，不含有所有彎曲菌屬中普遍存在的甲基化MK－6呼吸醌。

　　許多固體培養基能用作分離培養Hp的基礎培養基。例如：心腦浸液瓊脂、哥倫比亞瓊脂、布氏瓊脂和M－H瓊脂等。但必需加入適量的全血（馬、羊或人）或胎牛血清作為補充物。加入適量的活性炭（0.2%）或淀粉（1％）亦有利于吸收培養基中衍化產生的毒性氧離子。

Hp生長緩慢，通常需要3d～5d，甚至更長時間，才能形成針尖狀小菌落,為了避免快速生長的兼性厭O2菌和霉菌等和過度生長，常需加入由萬古霉素、TMP、兩性霉素、多粘菌素等組合的抑菌劑。Hp在液體培養基中生長更加困難。這可能與在液體里面更難保證菌體周圍穩定的微含O2量環境有關。

　　有人報告Hp能在33°C～40.5°C和pH6.6～8.4條件下生長。但實際應用中仍以37°C和pH7.0～7.2為最適條件。Hp對低ph 比一般細菌有較強耐受力。電鏡下，甚至偶然可見Hp鉆入壁細胞的分泌小管中。Clyne等認為酸對pH既有殺傷作用的一面，亦有保護作用的一面。

他們把尿素酶陽性的野生株N6和尿素酶陰性的突變株分別接種在含有或沒有10mmol尿素的兩個pH范圍從2.2到7.2的37°CPBS中,30min，然后測量CFU／ml、上清液的pH和溶液中的氨量。結果N6株在沒有尿素的pH4.5～7.0的PBS中生存良好，甚至在有尿素的超始pH為3.5的溶液中亦能生存。然而野生株和突變株均不能在堿性環境中生長繁殖。

存在野生株和尿素的酸性溶液的pH迅速從3.5升至8.45。尿素酶突變株在pH4.5～7.2的溶液中存活，不對尿素起反應。野生株N6暴露于氨的濃度高達80mmol仍能存活。胃的酸性環境可能對存活于尿素中的Hp有殺傷作用。但是Hp決不能存活于含有尿素的正常環境中，因為隨后升高的pH的危害性遠超過氨的毒性。

　　在血瓊脂中，Hp不能在含有5％膽汁的情況下生長。但是暴露于含有5％膽汁的液體培養基中30min，只有25％的Hp被殺死。這說明Hp通過十二指腸時尚有生存的可能性。

　　在含有0.1 %到1.5%甲基纖維素的1％蛋白胨的粘稠深液中，有周鞭毛的大腸桿菌在20CP（厘泊），即被制止運動。而Hp在10CP比1CP游動得更快，甚至在200CP的粘稠培養基中仍能游動。這可能與Hp的螺旋形特征及鞭毛的旋轉推動作用有關。由此，使Hp很容易穿透胃粘膜表面的粘液層，達到胃粘膜上皮細胞表面定居。而其他細菌很難達到這一點。

　　2.2.2 Hp的生化反應和酶

　　Hp對臨床實驗室中常用于鑒定細菌的大多數經典試驗不起反應。但是有幾種酶的反應是有特點的，特別是尿素酶，常用作Hp的生化鑒定。

　　尿素酶 尿素酶是Hp的一個非常重要的酶。它能使尿素分解成二氧化碳與氨。用柱層析方法測得其分子量約為625±kD，與底物有高度親和性。它與變形桿菌屬、摩根菌屬、普羅威登斯菌屬等許多微生物產生的尿素酶相比，在分子量大小、電泳活性、等電點和對尿素酶抑制劑的敏感性等方面都有它的獨特性。

Hp在固體培養基上和胃粘膜上能產生大量尿素酶，而且其酶的活性比其他微生物產生的尿素酶活性高幾倍到幾十倍，甚至更大。尿素酶不僅是Hp得以在胃粘膜表面定居的必要條件，可能也是Hp在胃部致病的重要因素之一。

傳統的測定尿素酶的方法，如Christensen尿素培養基等，均可用于測定Hp的尿素酶。由于Hp的發現和臨床上對快速診斷Hp感染的需要，已由此發展出了許多種更加簡便有效的或者能作非侵襲性體內診斷用的試驗。

　　其他可用于Hp常規鑒定用的酶試驗Hp的分離培養物的生化特性往往非常穩定。它們都能產生氧化酶、觸酶、尿素酶、堿性磷酸酶、α－谷氨酰胺肽酶、亮氨酸胺肽酶和DNA酶。不產生其他44種酶（包括許多種氨肽酶、酯酶、糖甙酶等）。常規鑒定可參見表1。

表1Hp與相關細菌的生化特征比較

　　aHp=Helicobacter pylori Ws:Wollinella succinegenes Hf=Helicobacter Cj:Campylobacter jejuni Hm=Helicobacter mustelaeNDb：未確定

　　2.2.3 對抗菌藥物的敏感性

　　在體外，Hp對大多數抗菌制劑敏感。但對萬古霉素和TMP高度耐藥。磺吡芐頭孢霉素（Cefsulodin），多粘菌素B及萘啶酸對少數菌株以外也都不起作用。這些抗菌藥物可用于制備Hp的選擇性培養基。

許多抗菌藥物在體外對Hp的高敏感性和在體內的低效或無效之間的矛盾，可能涉及許多因素。除了Hp自身發生的耐藥性突變外，恐怕還受到藥物在胃腔內對Hp作用的條件（胃酸作用的強度、不溶性粘液層的阻隔、不斷的排空運動等）影響。Hp對常用抗菌藥物的敏感性見表2。

近年來由于臨床上廣泛應用滅滴靈、克拉霉素（Clarithromycin）等抗菌藥物治療慢性胃炎及消化性潰瘍。因此，臨床上對這些藥物的耐藥菌株已越來越多見。

表2 Hp對常用27種抗菌制劑的敏感性