應用Orbitrap Fusion對TMT標記樣本進行MS2定量方法以及SPS MS3定量方法的比較
1. 前言
目前，蛋白質組學研究已經由傳統的大規模鑒定逐步轉向了靶向蛋白質組學，研究內容已經由蛋白質鑒定擴展到了蛋白質相對和絕對定量，蛋白質相對定量方法中應用最普遍的為標記定量，包括：ICAT，DIART，ICPL，TMT，iTRAQ 等等，其中又以TMT 以及iTRAQ 的應用最為廣泛。
傳統的TMT 以及iTRAQ 標記實驗均使用MS2 碎片報告離子來進行定量，但是Steven P Gygi 等人發現該方法由于母離子篩選過程易受到基質干擾，因而定量結果與真實值相比偏低，而使用MS3 碎片報告離子來進行定量，則可以很好的解決這一問題，該方法的基本原理為：母離子碎裂產生的MS2 子離子用于定性，同時挑選碎片離子中強度最高的一個或者多個碎片離子，使用HCD 進行進一步的碎裂，產生的報告離子用于定量，雖然質譜在選擇母離子時易受到基質的干擾，但是選擇出來的母離子中絕大部分為目標母離子，因而MS2 子離子中強度較高的碎片離子絕大部分來自于目標母離子，挑選這些子離子的報告離子去做定量，定量結果會顯著優于傳統的應用MS2 碎片報告離子的定量方法。
本文主要介紹了賽默飛世爾新一代三合一高分辨質譜儀Orbitrap Fusion 應用SPS MS3 定量方法以及MS2 定量方法對TMT 標記樣本進行定性與定量的實驗，并對兩種方法得到的結果進行了比較。結果顯示：MS2 定量方法比SPS MS3定量方法可以鑒定并定量到更多的蛋白質，而SPS MS3 定量方法與MS2 定量方法相比可以鑒定并定量到更多低豐度的蛋白質，同時其定量結果也更加可靠。
2. 實驗部分
2.1 樣品信息
小鼠DC 細胞系，分別進行兩種不同的處理，連同對照組，抽提蛋白質，酶解，分別使用TMT 標記為127，130，131，其中對照組標記為127，標記完成后，三種標記的樣本混勻，使用pH10，RP 梯度進行分級，共得16 個餾分。
2.2 實驗流程
樣本使用A 液（0.1% FA，H2O）復溶，均上樣4.5ul，60 min 色譜梯度分離，使用Orbitrap Fusion 對樣本進行定性以及定量分析，質譜方法分別使用傳統的MS2 定量方法以及SPSMS3 定量方法。
2.3 儀器條件
2.3.1 高效液相色譜條件
高效液相色譜儀：Thermo Scientific Easy-nLC 1000
色譜柱：Easy-spray column(C18 ,3 μm, 100? ,75 μm×15 cm)；
上樣量：均4.5 μL
流動相：A: 0.1% Formic acid in water； B: 0.1% Formic acid in Acetonitrile
色譜梯度：
2.3.2 質譜條件
2.3.2.1 MS2 定量方法
質譜儀： Orbitrap Fusion
噴霧電壓：2.1 kV
毛細管溫度：275℃
S-lens：60%
碰撞能量：40% HCD
分辨率設置：一級120000@m/z 200，二級15000@m/z 200
母離子掃描范圍：m/z 350-1800；子離子掃描范圍：start
from m/z 100
Isolation Mode：Quadrupole
Data Dependent Mode：Top Speed
Cycle Time：3s
Exclusion Time：70s
2.3.2.2 SPS MS3 定量方法
質譜儀： Orbitrap Fusion
噴霧電壓：2.1 kV
毛細管溫度：275℃
S-lens：60%
Data Dependent Mode：Top Speed
Cycle Time：3s
Exclusion Time：70s
MS1： Orbitrap
分辨率：120000@m/z 200
掃描范圍：m/z 400-1800
MS2: Ion Trap
Isolation Mode： Quadrupole
Activation Type： CID
Collision Energy：30%
MS3: Orbitrap
Precursor Exclusion：low：30，high:5
Number of Notches：10
Isolation Mode：Ion Trap
Activation Type：HCD
Collision Energy：65%
分辨率：30000@m/z 200
掃描范圍：m/z 100-400