彗星試驗原理及注意事項（一）

體內堿性彗星試驗原理及注意事項

體內堿性彗星試驗在化合物遺傳毒性評價中的應用日益廣泛。ICH S2(R1)已將肝臟彗星試驗列為第2個組織/終點的體內試驗；體內哺乳動物堿性彗星試驗的指導原則（TG489）也已頒布。體內堿性彗星實驗能夠檢測DNA鏈斷裂、堿性不穩定位點、不完整切除修復引起的DNA鏈的斷裂，能夠制成合適細胞懸液的組織DNA損傷。與其他試驗相比其檢測的是單細胞水平的DNA損傷，因此該試驗敏感性較高，操作簡單，經濟省時。

實驗原理

彗星實驗（comet assay）也稱單細胞凝膠電泳試驗（single cell gel electrophoresis.SCGE）,是一種有效評估DNA損傷的方法。其原理是器官或組織經處理（如輻射、重金屬等）后，細胞中的DNA發生單鏈或雙鏈斷裂，經細胞及其核膜裂解后，DNA解旋，在電場作用下，DNA 斷片遷移出細胞核，形成彗星狀的電泳圖譜。正常細胞的大分子DNA在電場作用下遷移距離較短，DNA仍保留在細胞核的范圍，形成圓形或輕微拖尾的圖譜。根據電泳緩沖液的pH值不同，可分為中性彗星實驗（pH=8.4）和堿性彗星實驗（pH＞13）。中性彗星實驗主要用于檢測DNA雙鏈的斷裂損傷，堿性彗星實驗具有更高的靈敏性，可用于檢測更少量的單鏈和雙鏈斷裂損傷。

需要注意的是，試驗過程中的個方面，包括樣品準備、電泳條件、視覺分析參數(如染色強度、顯微鏡光強度以及使用顯微鏡濾鏡和相機動態和環境條件(如背景照明)已經被研究，可能影響DNA遷移。
 

堿性彗星實驗指導原則

TG489 In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay，2016，OECD Guideline for the Testing of Chemicals

試驗能力驗證

每個實驗室都應證明能夠為所使用的目標組織獲得足夠質量的單細胞或細胞懸浮液，從而在彗星試驗（comet assay）中建立實驗能力。匯智泰康擁有多年毒理學服務與產品研發經驗，針對不同遺傳毒性試驗開發針對試劑盒，包括彗星試驗試劑盒。首先通過%尾DNA的評價，對照處理組動物%尾DNA在低范圍內。目前的數據表明,尾部DNA百分比(基于平均中位數)在大鼠肝臟應該最好不要超過6%,這將是符合JaCVAM驗證試驗的值和其他出版和私有數據。目前還沒有足夠的數據對其他組織的最佳或可接受范圍提出建議。這并不排除合理使用其他組織。測試報告應根據已發表的文獻或專有數據，對彗星試驗在這些組織中的性能進行適當的審查。首先，在對照組中，需要一個較低的%尾DNA范圍，以提供足夠的動態范圍來檢測陽性的影響。其次，每個實驗室都應能夠按照表1所建議的不同方式，對直接誘變劑和促進劑的反應。
 

表一：陽性對照物質及其部分靶組織

應收集陰性對照數據，以證明陰性數據反應的再現性，并確保對檢測的技術方面進行適當控制，或建議需要重新建立歷史控制范圍。

歷史對照

在實驗室能力驗證過程中，實驗室應建立歷史數據庫，建立相關組織和物種的陽性和陰性對照范圍和分布。不同的組織和不同的物種，以及不同的給藥溶媒和給藥途徑，可能會產生不同的%尾DNA陰性對照值。因此，建立每個組織和物種的陰性對照范圍是很重要的。實驗室應采用質量控制方法，以確定其數據的變化程度，并表明該方法在其實驗室中得到了“控制”。可能還需要優化選擇適當的陽性對照物質、劑量范圍和實驗條件(例如電泳條件)，以便發現微弱的影響。

對實驗方案的任何更改都應根據其與實驗室現有歷史控制數據庫的一致性加以考慮。任何重大的不一致都應導致建立新的歷史控制數據庫。

方法描述

動物選擇：通常使用健康成年嚙齒動物(6-10周齡，但年齡稍大的動物也可接受)。然而，如果合乎倫理和科學，其他物種也可以被利用。

動物準備：動物隨機分為對照組和實驗組。在開始實驗前，這些動物適應實驗室條件至少5天，給予標識識別。試驗開始時,動物的重量差異應該不超過±20%。

樣品制備：在給動物給藥前，固體測試化學品應溶解或懸浮在適當的溶媒中，或混合在飲食或飲用水中。液體試驗化學品可直接加藥或在加藥前稀釋。對于吸入暴露，根據其物理化學性質，試驗化學品可以作為氣體、蒸汽或固體/液體氣溶膠使用。

溶媒：在使用的劑量范圍內，溶媒不應產生毒性作用，也不應與試驗物質發生化學反應。如果使用的不是常用溶媒應提供參考數據，說明它們在測試動物、管理路線和終點方面的兼容性。建議在可能的情況下，應首先考慮使用水性溶劑/溶媒。值得注意的是，一些溶劑可誘導炎癥反應，增加接觸部位DNA鏈斷裂的背景水平，尤其是與多藥給藥時。

陰性對照：陰性對照動物，單獨用溶媒處理，其他處理方法與治療組相同，每一次采樣時間和組織的每次檢測均納入一組陰性對照動物。陰性對照動物的尾部DNA應在每個組織預先設定的實驗室背景范圍和該物種的取樣時間內。

動物數量和性別：目標是每組提供至少5只可分析的單性別動物，或如果使用兩種動物，則每組至少提供5只可分析的單性別動物。如果人類接觸到的化學物質可能具有性別特異性，例如某些藥物，則應在適當的性別下進行檢測。三個劑量組和同時進行的陰性和陽性對照(每一組由5只單性別動物組成)，將需要25至35只動物。

試驗計劃：動物應接受為期2天或以上的每日給藥(即每隔約24小時進行兩次或兩次以上)，并在最后一次治療后的2-6小時采集一次樣本。延長劑量方案(如28天每日給藥)的樣本是可以接受的。測試化學品也可以分次使用，即，兩組給藥在同一天間隔不超過2-3小時，便于給藥量大。在這種情況下，取樣時間應根據最后一次給藥的時間來安排。

劑量水平：對無毒試驗化學品，給藥14天以上的，最大(限)劑量為1000mg /kg體重/天。給藥時間少于14天，最高劑量為2000毫克/公斤體重/天。對于特定法規所涵蓋的特定類型的測試化學品(如人類藥物)，這些限制可能有所不同。在長期給藥后表現出毒物動力學性質飽和或誘導排毒過程而可能導致接觸減少的物質，可能是劑量設定標準的例外，應逐個進行評估。

急性和亞急性的彗星試驗,除了最大劑量(MTD,最大可行的劑量,最大接觸或限制劑量)遞減序列至少兩個額外的適當間隔的劑量水平(最好相隔不到√10)應該選擇為每個采樣時間證明劑量相關的反應。但是，所使用的劑量水平也最好包括從最大限度到產生很少或沒有毒性的劑量范圍。當檢測到所有劑量水平的靶組織毒性時，建議進一步進行無毒劑量的研究。為了更全面地調查劑量-反應曲線的形狀，可能需要進行研究。

在設計試驗時，應考慮人體接觸的預期途徑。因此，暴露途徑，如飲食、飲水、局部、皮下、靜脈、口服(灌胃)、吸入、氣管內或植入術可能是合理的。無論如何，應選擇適當的路徑以確保目標組織得到充分暴露。腹腔注射通常不推薦使用，因為它不是典型的人體接觸的相關途徑，只能在有特定理由的情況下使用(例如，一些陽性對照物質，用于調查目的，或用于腹腔注射途徑所使用的某些藥物)。一次灌胃或注射液體的最大容量取決于試驗動物的大小。體積不應超過1毫升/100克體重，但可使用2毫升/100克體重的水溶液除外。如果動物福利立法允許，使用比這更多的量是合理的。在可能的情況下，應通過調整劑量配方的濃度來達到不同的劑量水平，以確保在所有劑量水平上的體積相對于體重是恒定的。

采樣時間：采樣時間是一個關鍵變量，因為它是由測試化學物質在目標組織中達到最大濃度所需的時間和DNA鏈斷裂的誘導時間決定的，但在這些斷裂被移除、修復或導致細胞死亡之前。彗星實驗（comet assay）檢測到的一些導致DNA鏈斷裂的損傷持續時間可能很短，至少對于一些體外測試的物質來說是這樣。因此，如果懷疑這種短暫的DNA損傷，應采取措施減輕其損失，確保組織得到足夠早的采樣，可能早于下面給出的默認時間。最佳采樣時間可能是特定于物質或路徑的采樣時間，例如，靜脈給藥或吸入給藥導致組織快速暴露。因此，在可能的情況下，應根據動力學數據(如血漿或組織濃度達到峰值的時間(Tmax)或多次給藥的穩態時間(Cmax)確定采樣時間。在缺乏動能的測量數據合適的妥協基因毒性是樣品2-6 h后給藥兩次或兩次以上,或2-6和第16 - 26 h后。關于目標器官中毒性作用外觀的信息也可用于選擇適當的取樣時間。

組織收集：
因為它可以研究誘導的DNA鏈斷裂(彗星)在任何組織中,組織選擇應清晰、基于收集的原因進行研究與任何現有的基因毒性、致癌性或其他測試物質的毒性數據在調查之中。應考慮的重要因素應包括給藥途徑、預測的組織分布和吸收、代謝的作用以及試驗物質可能的作用機制。肝臟是研究最頻繁、數據最豐富的組織。因此，在缺乏任何背景信息的情況下，如果沒有確定感興趣的特定組織，那么對肝臟進行取樣是合理的，因為肝臟是異種生物代謝的主要場所，而且常常高度暴露于母體物質和代謝物中。在某些情況下，直接接觸部位的檢查(例如，口服藥物，胃腺或十二指腸/空腸，或吸入藥物，肺)可能是最相關的。應根據進行測試的具體原因選擇其他或替代組織，但如果實驗室已證明對這些組織的熟練程度和同時處理多個組織的能力，對同一動物的多個組織進行檢查可能是有用的。