微生物多樣性分析的常見問題

　　一般做二代測序（即擴增子測序）可以鑒定到屬，三代一般是測菌的全長，信息量更多一些，有一些種屬可以精確到種的信息，但是個別親緣關系很近的，不一定能鑒別開。

　　1.微生物多樣性是否能鑒定到菌株的種或者屬？測全長和擴增子有什么區別？

　　一般做二代測序（即擴增子測序）可以鑒定到屬，三代一般是測菌的全長，信息量更多一些，有一些種屬可以精確到種的信息，但是個別親緣關系很近的，不一定能鑒別開。 真菌、細菌、古菌全長引物包含區段引物序列（V3V4，IT1區等)，全長可以更準確的物種分類，更多的物種鑒定，能精確定位到“種”水平。 全長測序使用三代測序平臺。基于PacBio 測序平臺測序，相比較二代測序只選擇 1-2 個高變區進行測序，三代可以獲得全長的序列，更多變異區信息可以提高物種鑒定的分辨率，還可以提高對于群落組成的鑒定的精度，更加真實的還原樣本中微生物群落結構。

　　2.16s擴增子測序和宏基因組的區別？

　　①普通16S擴增子測序： 一般是通過對16S V3或V4區（大概200-300bp）PCR擴增建庫后，進行高通量測序，選擇這兩個區域的原因是可檢測的物種多樣性更豐富，并且可重復性強，二代測序的讀長可達到500bp，檢測結果無需拼接。缺點是由于序列長度有限，對樣品的鑒定一般只能精確到屬。 ②16S全長擴增子測序：16SrDNA的全長大約為1500bp，通常來說足夠鑒定到種，其實現有兩種方法：其一是通過二代測序，不同于V3V4區測序，16S全長超過了二代測序的有效讀長，因此需要對結果進行拼接，此外，必須提高16S全長序列的質量，測序結果才能精確，因此對技術人員的操作要求也較高；其二是通過三代測序，它的優勢是擁有超長的讀長，16S全長測序結果無需拼接，其缺點就是錯誤率高，通量低，成本昂貴。 ③宏基因組測序：是對樣本中全部基因進行測序注釋，能鑒定微生物到種水平甚至菌株水平，宏基因組測序在16S測序分析的基礎上還可以解釋環境樣本中的功能組成及代謝通路等信息，主要用于深入挖掘環境樣本功能層面的信息。它的技術原理是將微生物基因組DNA隨機打斷成較小片段，然后在片段兩端加入通用引物進行PCR擴增測序，再通過組裝的方式，將小片段拼接成較長的序列，由于宏基因組測序結果數據量巨大，耗時更長，操作流程也更復雜，因此收費也更高。 一個細菌分類地位的最終確定，需要做多相分類分析，包括形態，生理生化，進化和分子等特征，以后還會包括基因組分析。16S的數據只是一個參考值。