隨著現代醫學及相關科學技術的發展，各學科相互交叉和滲透，醫學微生物學檢驗技術已深入到細胞、分子和基因水平，許多新技術、新方法已在臨床微生物實驗室得到廣泛應用。醫學微生物學實驗室的基本任務之一是利用微生物學檢驗技術，準確、快速檢驗和鑒定臨床標本中的微生物，并對引起感染的微生物進行耐藥性監測，為臨床對感染性疾病診斷、治療、流行病學調查及研究等提供科學依據。
第一節 微生物形態學檢查
細菌形態學檢查是細菌檢驗的重要方法之一，它是細菌分類和鑒定的基礎，可根據其形態、結構和染色反應性等，為進一步鑒定提供參考依據。
一、顯微鏡檢查
由于細菌個體微小，肉眼不能看到，必須借助顯微鏡的放大才能看到。一般形態和結構可用光學顯微鏡觀察，其內部的超微結構則需用電子顯微鏡才能看清楚。常用顯微鏡有如下幾種。
1．普通光學顯微鏡
采用自然光或燈光為光源，其波長約為0.4μm。顯微鏡的分辨率為波長的二分之一，即0.2μm，而肉眼可見的最小形象為0.2mm。故用油（浸）鏡放大1
000倍，能將0.2μm的微粒放大成肉眼可見的0.2mm。普通光學顯微鏡可用于細菌、放線菌和真菌等的觀察。
2．暗視野顯微鏡
常用于觀察不染色微生物形態和運動。在普通顯微鏡安裝暗視野聚光器后，光線不能從中間直接透入，視野呈暗色，當標本接受從聚光器邊緣斜射光后可發生散射，因此可在暗視野背景下觀察到光亮的微生物如細菌或螺旋體等。
3．相差顯微鏡
相差顯微鏡利用相差板的光珊作用，改變直射光的光位相和振幅，將光相的差異轉換為光強度差。在相差顯微鏡下，當光線透過不染色標本時，由于標本不同部位的密度不一致而引起光相的差異，可觀察到微生物形態、內部結構和運動方式等。
4．熒光顯微鏡
熒光顯微鏡與普通光學顯微鏡基本相同，主要區別在于光源、濾光片和聚光器。目前大多數使用的是落射光裝置，常用高壓汞燈作為光源，可發出紫外光或藍紫光。濾光片有激發濾光片和吸收濾光片二種。用藍光的熒光顯微鏡除可用一般明視野聚光器外，也可用暗視野聚光器，以加強熒光與背景的對比。本法適用于對熒光色素染色或與熒光抗體結合的細菌的檢測或鑒定。
5．電子顯微鏡
用電子流作為光源，波長與可見光相比差幾萬倍，大大提高了分辨力，并用磁性電圈作為光學放大系統，放大倍數可達數萬倍或幾十萬倍，常用于病毒顆粒和細菌超微結構的觀察。
二、不染色標本檢查
不染色標本一般可用于觀察細菌形態、動力及運動情況。細菌未染色時無色透明，在顯微鏡下主要靠細菌的折光率與周圍環境的不同來進行觀察。有鞭毛的細菌運動活潑，無鞭毛的細菌則呈不規則布朗運動。梅毒蒼白密螺旋體、鉤端螺旋體、彎曲桿菌等的活菌各有特征鮮明的形態和運動方式，具有診斷意義。常用的方法有壓滴法、懸滴法和毛細管法等。
1．懸滴法
在潔凈凹玻片的凹孔四周涂上凡士林，用接種環取一環菌懸液放在蓋玻片中央，再將凹玻片的凹孔對準蓋玻片中央的液滴并蓋上，然后迅速翻轉，輕壓蓋玻片，使其與凹孔邊緣的凡士林粘緊封閉后置高倍鏡下（或暗視野）觀察。
2．壓滴法
用接種環取一環菌懸液置于潔凈玻片的中央，在菌懸液上輕輕蓋上一蓋玻片，注意避免產生氣泡并防止菌懸液外溢，靜止數秒鐘后置高倍鏡下明視野（或暗視野）觀察。
3．毛細管法
主要用于厭養菌動力的檢查。通常選用60~70mm長。0.5~1.0mm孔徑的毛細管虹吸厭養菌懸液后，用火焰將毛細管兩端熔封。并用塑膠紙將毛細管固定在載玻片上，置高倍鏡下暗視野觀察。
三、染色標本檢查
細菌標本經染色后，由于細菌與周圍環境間在顏色上形成鮮明對比，故在普通光學顯微鏡下可清楚地觀察到細菌的形態特征（如細菌的大小、形狀、排列等）和某些特殊結構（如莢膜、鞭毛、芽孢等），并可根據染色反應性對細菌加以分類鑒定。
（一）細菌染色的一般程序
細菌染色的一般程序是：涂片（干燥）—固定—染色（媒染）—（脫色）—（復染）。
1．涂片制備
血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液體培養物，直接在載玻片上作薄膜涂片；尸檢或感染動物組織，病變局部涂抹采樣的棉拭子直接涂片。固體培養基上的菌落或菌苔的制片，先用接種環取一環生理鹽水置載玻片中央，再用無菌接種環取少量的培養物在生理鹽水中磨勻，涂布成1cm2大小的涂面，置室溫下自然干燥或遠火慢慢烘干。
2．固定
目的是殺死細菌，凝固細菌蛋白及結構，便于染色；促使細菌粘附在載玻片上，避免在水洗過程中被水沖掉；改變細菌對染料的通透性，有利于菌細胞內結構的染色。通常用火焰加熱固定，將已干燥的涂片在火焰中迅速通過3次，以手背皮膚接觸玻片不燙為佳。
3．染色
根據檢驗目的不同，選擇不同的染色方法進行染色。染色時滴加染液，以復蓋標本為度。
4．媒染
凡能增強染料和被染物的親和力，使染料固定于被染物及能引起細胞膜通透性改變的物質，稱媒染劑。常用的有明礬、鞣酸、金屬鹽和碘等，也有用加熱法促進著色。媒染劑可用于初染與復染之間，也可用于固定之后或含于固定液、染色中。
5．脫色
凡能使已著色的被染物脫去顏色的化學試劑稱為脫色劑。常用乙醇、丙酮等作為脫色劑。脫色劑可以查出細菌與染料結合的穩定程度，作為鑒別染色之用。
6．復染
已脫色處理的細菌或其結構常以復染液作復染以便于觀察。復染液與初染液的顏色不同而成一鮮明對比。復染不宜太強，以免掩蓋初染的顏色。
（二）常用染色法（染液配方見第8章）
1. 單染色法
只用一種染料染色。由于大多數細菌胞漿內含有酸性物質，可與堿性染料結合，故常用呂氏美藍、結晶紫和稀釋石碳酸復紅等染液。此法可觀察細菌的大小、形態與排列，不能顯示細菌的結構與染色特性。
2．復染色法
用兩種或兩種以上不同染料可將細菌染成不同的顏色，除可觀察細菌的大小、形態與排列外，還反應出細菌染色特性，具有鑒別細菌種類的價值。常用的有革蘭染色法和抗酸染色法。
（1）革蘭染色：①細菌涂片經火焰固定，加結晶紫染液染1min，清水沖去染液。②加碘液媒染
1min，水洗，甩干。③用95%乙醇脫色，輕輕搖動約30s，至無紫色洗落為止，水洗，甩干。④加稀釋石碳酸復紅或沙黃染液數滴進行復染，約30s，水洗。⑤干后顯微鏡下鏡檢觀察結果，革蘭陽性菌染成紫色，革蘭陰性菌為紅色。
（2）抗酸染色：萋-尼
(Ziehl-Neelse)抗酸染色法：①細菌涂片經火焰固定，加石炭酸復紅溶液，徐徐加熱至有蒸氣出現，切不可沸騰。染液因蒸發減少時，應隨時補充，防止染液蒸干。持續染5min（奴卡菌需要加長時間），水洗，甩干。②滴加3%鹽酸乙醇脫色，不時搖動玻片至無紅色脫落為止，水洗，甩干。③加呂氏美藍復染液數滴復染1min，水洗。④干后顯微鏡下鏡檢觀察結果，抗酸桿菌染成紅色，非抗酸桿菌為藍色。
金胺O-羅丹明B染色法：①細菌涂片固定后加第1液30~90s。②棄去第1液后加第2液染15min。③用第3液脫色1~2min，水洗。④滴加第4液染30s，水洗，⑤干后置熒光顯微鏡下鏡檢觀察結果 在淡藍色背景下，抗酸桿菌呈紅色，其它細菌和細胞呈藍色。
3．特殊染色法
（1）鞭毛染色（改良Ryu法）：①玻片的處理
將新載玻片浸泡在95%乙醇中。臨用時取出，以干凈紗布擦干。②在玻片上滴蒸餾水1滴。③挑取培養物少許，輕觸蒸餾水滴頂部，僅允許極少量細菌進入水滴，不可攪動，以免鞭毛脫落。④置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加鞭毛染液染1~2
min輕輕水洗。⑤干后顯微鏡鏡檢觀察結果 鞭毛和菌體呈紫色。
（2）異染顆粒染色(阿爾培托法)：①細菌涂片經火焰固定，加甲液染色3~5min。水洗。②滴加乙液，染1min。水洗。③干后顯微鏡鏡檢觀察結果 菌體呈綠色，異染顆粒呈藍黑色,用于白喉棒狀桿菌染色。
（3）莢膜染色：①奧爾特莢膜染色法：將已固定的細菌涂片滴加3%沙黃染液，用火焰加溫染色，持續3min，冷卻后水洗，待干鏡檢。結果：菌體呈褐色，莢膜呈黃色，此法主要用于碳疽芽胞桿菌。②Hiss氏硫酸銅法：染液：第一液為結晶紫乙醇飽和液5ml加蒸餾水95ml
的混合液；第二液為20%硫酸銅水溶液。方法：細菌涂片自然干燥，乙醇固定。滴加第一液，微加熱染1min。再用第二液將涂片上的染液洗去，勿再水洗，傾去硫酸銅液，以吸水紙吸干鏡檢。結果：菌體及背景呈紫色，莢膜呈鮮藍色或不著色。
（4）芽胞染色：染液：第一液為萋－納氏石炭酸復紅液，第二液為95%乙醇，第三液為堿性美藍液。方法：將已固定的細菌涂片滴加第一液，微加熱染5min，冷卻后水洗。用第二液脫色2min，水洗。加第三液復染1min，水洗，待干鏡檢。結果：菌體呈藍色，芽胞呈紅色。
4．負染色法
背景著色而菌體本身不著色的染色為負染色法。最常見的是墨汁負染色法，用來觀察真菌及細菌莢膜等。在標本涂片處滴加染液，混合后加上蓋玻片(勿產生氣泡)，輕壓。在低倍鏡下尋找有莢膜的菌細胞，轉高倍鏡或油鏡確認，如新型隱球菌可見寬厚透亮的莢膜，背景為黑色。
5．熒光染色法
經熒光素染色的細菌，或熒光素標記的熒光抗體與相應抗原的細菌、病毒結合形成的復合物，在熒光顯微鏡下發出熒光。
微生物培養與分離方法
大多數細菌均可以通過人工方法培養，而衣原體和病毒的分離培養往往需要活組織、雞胚、特殊細胞株及動物接種。只有將微生物培養出來才能對它進行研究、鑒定和應用。