磷酸化修飾被很多研究者認為是修飾之王，是生物體內極為重要的一種翻譯后修飾：從數量上來說，真核生物體內有超過三分之一的蛋白可以發生磷酸化修飾；從功能上來說，磷酸化在正常生理、免疫應答、疾病的發生發展，及植物的逆境脅迫響應與激素表達等各種生物過程中均發揮至關重要的作用。
近期微信公眾號，我們陸續解讀了多篇磷酸化相關的高水平研究論文。
醫學領域
Science重磅：缺覺會擾亂98%的突觸蛋白磷酸化周期
腦組織深度蛋白質組+磷酸化，描繪阿爾茨海默病進展分子網絡
Nature重磅|磷酸化組揭示寨卡病毒致大腦病變機制
植物領域
Nat Commun：磷酸化蛋白組學解析高等植物激酶級聯介導早期滲透脅迫信號
Nature plants！多組學聯合解析植物對茉莉酸的響應調控網絡
值得注意的是，這些文章都選擇了磷酸化蛋白質組+蛋白質組聯合檢測分析的方式展開研究。大家可能有這樣的疑問：為什么檢測了磷酸化蛋白質組，還要再檢測蛋白質組呢？這里，小編為您剖析一下蛋白質組+磷酸化組到底解決了哪些單組學無法解釋的問題。
1. 可以從多個維度系統剖析調控機制
生物體是一個非常復雜的調控網絡，單個組學只能解釋某一個分子層面的變化——蛋白質組只能表征蛋白表達水平的變化，而磷酸化組只能表征磷酸化修飾水平的變化。如果只做蛋白質組學，有時候會遺漏修飾水平的重要變化。例如發表于《Science》關于晝夜節律變化的研究顯示：前腦突觸神經元中的磷酸化修飾變化明顯獨立于蛋白豐度的變化，且磷酸化水平的平均振幅比蛋白質水平的平均振幅大10倍[1]（圖1）。
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圖1 晝夜節律變化中的蛋白質組與磷酸化組擾動情況[1]
其次，如果只做磷酸化，無法區別表達與修飾到底誰在起作用，不能全面反映蛋白功能的變化原因。
例如《Neuron》上關于阿爾茨海默病的研究中，差異表達的蛋白分子主要是一些轉運蛋白，而差異磷酸化修飾主要發生在微管蛋白Tau上[2]。更為有趣的是，在數百個差異表達和差異磷酸化蛋白中，只有11個蛋白是重合的（圖2）。而在《Nature plants》上發表的一項研究顯示：擬南芥響應茉莉酸信號的過程中，差異磷酸化主要發生在可變剪接相關功能的蛋白上，進而影響植物防御信號通路上蛋白表達的差異[3](圖3)。
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圖2 阿爾茲海默蛋白質組&磷酸化組表達差異概況[2]
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圖3 擬南芥響應茉莉酸信號的差異蛋白及差異磷酸化蛋白數據對比[3]
2. 找出特異性磷酸化修飾差異位點
基于目前的修飾組學定量技術，我們能夠獲得某個特定修飾肽段在不同樣本間的相對含量差異。但是，由此就會引出一個問題：如果某個蛋白的表達量上調2倍，蛋白上某個修飾肽段的含量也上調2倍，那么最終表型的差異究竟是由于蛋白表達量還是磷酸化修飾起關鍵作用呢？這種情況在生物體內非常常見，4月20日哈佛醫學院李嘉銘博士在《TMT串聯質譜標簽系統在大規模酵母（磷酸化）定量蛋白質組學中的應用，以及新一代串聯質譜標簽系統TMTpro實現16通道蛋白質組定量分析》講座中，提到關于酵母磷酸化組學的研究，約有50%的磷酸化差異是由于蛋白背景變化而引起的[4]（圖4）（講座鏈接：【Nature Methods一作】 哈佛大學醫學院李嘉銘博士分享新一代TMTpro前沿蛋白質組技術），因此建議在具體關注某個位點磷酸化差異時，同時關注下蛋白表達量，以便找出與表型最相關的特異性修飾位點。但后續答疑中也提到：如果磷酸化的富集效率不夠高，或是磷酸化蛋白組以及蛋白組的檢測深度一般，數據的覆蓋度比較低，這種情況下用蛋白水平校正會存在一些操作上的難度，可能存在大量鑒定到肽段但沒有鑒定到磷酸化肽段，或者鑒定到磷酸化肽段沒有鑒定到非修飾肽段的情況。因此目前定量扣除蛋白表達背景的方式更適用于酵母這類數據覆蓋度較高的物種。在高等動植物的研究中，重點可以關注那些蛋白表達無差異，而磷酸化修飾有差異的蛋白及其功能（圖2G）。
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圖4 磷酸化修飾水平與蛋白表達水平具有非常高的關聯性[4]
3. 深度挖掘激酶與底物磷酸化的調控關系
激酶在磷酸化修飾過程中起到了非常核心的調控作用。激酶的表達、激酶的磷酸化修飾水平的改變會直接調節其它激酶和下游蛋白底物的磷酸化修飾程度。Matthias Mann課題組近期在《Cell Metabolism》上發表的一篇關于2型糖尿病的研究，利用蛋白質組學和磷酸化組學的聯合分析，以及激酶-底物的預測分析，發現了一個關鍵激酶GSK3會通過影響beta細胞特異性轉錄因子PDX1的磷酸化修飾來調節胰島素分泌能力，進一步通過藥物抑制GSK3的激酶活性，可以恢復2型糖尿病胰島素分泌能力[5]。
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圖5 GSK3-PDX1軸在胰島細胞信號調控中起著關鍵作用[5]
由此，我們可以看出蛋白磷酸化組學與蛋白質組學聯合的重要性——從更全面的角度剖析調控網絡及機制，更好地解釋表型背后的分子機制及因果關系；也可通過蛋白表達和修飾的異同對特定位點磷酸化修飾的表型功能做出更準確的判斷。
那么這些分析怎么做呢？不用擔心，小編在此預告一下，中科新生命即將推出蛋白組學和磷酸化組學聯合分析，包括—非蛋白表達依賴差異磷酸化位點功能富集、激酶注釋、激酶-底物網絡圖分析等多項實用分析內容，敬請期待！
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參考文獻
[1] Brüning F., Noya S. B., Bange T., et al., Sleep-wake cycles drive daily dynamics of synaptic phosphorylation. Science, 366(6462), 3617 (2019).
[2] Bai B., Wang X., Li Y., et al., Deep multilayer brain proteomics identifies molecular networks in Alzheimer's Disease progression. Neuron, 105(6), 975 (2020).
[3] Zander M., Lewsey M.G., Clark N.M. et al., Integrated multi-omics framework of the plant response to jasmonic acid. Nat. Plants 6, 290–302 (2020).
[4] Li J., Paulo J.A., Nusinow D.P., et al., Investigation of proteomic and phosphoproteomic responses to signaling network perturbations reveals functional pathway organizations in yeast.
[5] Sacco F., Seelig A., Humphrey S.J., et al., Phosphoproteomics reveals the GSK3-PDX1 axis as a key pathogenic signaling node in diabetic islets. Cell Metabolism 29(6), 1422-1432 (2019).
