核酸凝膠電泳2

二、核酸電泳的指示劑與染色劑
【指示劑】
電泳過程中，常使用一種有顏色的標記物以指示樣品的遷移過程，核酸電泳常用的指示劑有兩種：溴酚蘭，呈藍紫色；二甲苯青，呈藍色。溴酚藍分子量為670道爾頓，在不同溶液凝膠中，遷移速度基本相同，其分子篩效應小，近似自由電泳。在0.6%、1%、2%的瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚藍的遷移率分別與1kb 0.6kb 0.15kb的雙鏈線性DNA片段大致相同。在5%的PAG和含7~8mol/L尿素PAG中，分別與65mer和35mer的寡聚核苷酸遷移率相同。
二甲苯青的分子量為554.6道爾頓，其荷電量比溴酚藍少，在凝膠中遷移率比溴酚藍慢，在0.1%瓊脂糖凝膠電泳中遷移率相當于4kb的雙鏈線性DNA片段。在5%的PAG和含7~8ml/L尿素PAG中遷移率分別相當與260mer和130mer的寡核苷酸。

指示劑一般加在電泳上樣緩沖液中，為確保進入樣品孔中，還需加入適量的蔗糖，甘油或聚蔗糖400以增加密度。
【染色劑】
電泳后，核酸需經染色才能顯色出帶型，常用以下核酸染色劑：
1、溴化乙錠（ethidium bromide, EB）
最常用的核酸熒光染料，可嵌入核酸雙鏈的配對堿基之間，在紫外線激發下，發出桔紅色熒光。EB-DNA復合物中的EB發出的熒光，比游離的凝膠中的EB發出的熒光強度大10倍，因此無需洗凈背景即可清楚觀察核酸帶型。若EB背景太深，可將凝膠浸泡于1mmol/LMgSO4中1h或10mmol/L MgCl2中5min，使非結合的EB褪色，這樣可檢查到10ng的DNA樣品，EB也可用于檢測單鏈DNA或RNA，但其對單鏈核酸的親和力相對較小，熒光產率也相對較低。
在凝膠或電泳緩沖液中加入終濃度為0.5μg/ml的EB，染色可在電泳過程中進行，能隨時觀察核酸的遷移情況。但EB帶正電荷，嵌入堿基后增加了核酸分子的剛性，使遷移率減慢，故不宜用于測定核酸分子量的大小，這時應在電泳后將凝膠浸入0.5μg/ml的EB水溶液中10min進行染色。EB見光易分解，應于4℃避光保存，
2、吖啶橙（acridine orange, AO）：
吖啶橙可嵌入雙鏈核酸堿基對之間，在254nm紫外線激發下發出530nm的綠色熒光；還通過靜電與單鏈核酸的磷酸基結合，在254nm紫外線激發下產生640nm的紅色熒光。因此可區分單鏈和雙鏈核酸，靈敏度分別為0.1μg和0.05μg。但吖啶橙的染色操作要求嚴格，應在22℃，0.01mol/L磷酸鈉緩沖液（pH7.0）中避光浸泡30min，然后在搪瓷盤中用該緩沖劑4℃脫色過夜或22℃脫色1~2小時。
3、銀（Ag+）試劑：
Ag+與核酸形成穩定復合物，然后用甲醛使Ag+還原成銀顆粒。AgNO3等試劑可使聚丙烯酰胺凝膠上的單鏈，雙鏈DNA及RNA都染成黑褐色。銀染法的靈敏度比EB染色高200倍左右，比亞甲藍染色高100~1000倍，在小于0.5mm厚的凝膠中，能檢測出0.5ng的RNA，其缺點是專一性不強，能與蛋白質，去污劑反應也產生褐色，而且對DNA的染色定量不準確。銀與DNA穩定結合，對DNA有破壞作用，不適于DNA片段回收的制備。
4、亞甲藍（methylene blue）
可將RNA染成藍色，但靈敏度不高，而且操作時間長。染色過程：膠浸泡于0.02%的亞甲藍，10mmol/L Tris-Ac（pH8.3），4℃放置1~2h，用凈水洗5~8h（反復換水），帶型肉眼可見，最低檢測量為250ng。

三、DNA的瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖主要從海洋植物瓊脂中提取來的，為一種聚合線性分子，一般含有多糖、蛋白質和鹽等雜質，雜質的含量每個廠商和批號的產品不盡相同。對DNA電泳遷移率的影響也不一樣，經化學修飾后熔點降低的瓊脂糖叫低熔點瓊脂糖，其機械強度無明顯變化，主要用于DNA的限制酶原位消化、DNA片段回收以及小DNA片段（10~500bP）的分離。瓊脂糖凝膠的孔徑取決于瓊脂糖的濃度。
【原 理】
DNA分子帶負電荷，在電場中受到電荷效應、分子篩效應向正極移動過程中，因DNA分子的大小及構象差別而呈現遷移位置上的差異，對于線形DNA分子，其電場中的遷移率與其分子量的對數值成反比，電泳時加溴化乙錠，其與DNA結合形成一種熒光絡合物，在254~365nm紫外照射下可產生桔紅色的熒光，可用于檢測DNA。（此法可觀察到凝膠中2ng的DNA）。如有必要可從凝膠回收DNA片段，用于分子克隆或探針標記等操作。瓊脂糖可制成不同孔徑的凝膠，分離DNA的范圍廣，約200bp~50kb。
【試劑與材料】
1、5×TBE 緩沖液（pH8.3）
89mmol/L Tris
89mmol/L 硼酸
2mmol/ L EDTA
2、0.5×TBE緩沖液（pH8.3）
3、溴化乙錠（EB）：5mg/ml
4、1~2%瓊脂糖凝膠：瓊脂糖1~2克加0.5×TBE緩沖液至100ml，于錐形瓶中水浴煮沸20~30min或微波爐加熱熔解備用。
5、6×上樣緩沖液：（4℃保存）
0.25%溴酚蘭，0.25%二甲苯青FF，30%甘油溶于水中
6、DNA分子量標準
【操作步驟】
1、瓊脂糖凝膠板的制備：將1~2%瓊脂糖凝膠加熱溶化均勻，冷卻到60~70℃加EB至濃度0.5μg/ml，倒入封好的凝膠槽，厚度約3~5mm，在距底板0.5~1mm的位置放置樣品梳，檢查梳子齒間有無氣泡，可用吸管小心吸出氣泡，待冷卻成形后取出梳子及隔板，放入水平電泳槽中，緩沖液淹沒過膠1~2mm為止。
2、加樣：樣品中加1/5體積的上樣緩沖液，混勻，取10~15μl加入凝膠點樣孔中，同時要設立合適的DNA分子量標準物。