核酸探針標記及原位雜交

一、核酸探針標記

核酸探針分子雜交是指具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強度等）可按堿基互補原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。雜交的雙方是待測核酸及探針。

核酸探針根據核酸的性質，可分為DNA和RNA探針；根據標記物不同，可分為放射性標記探針和非放射性標記探針兩大類；根據是否存在互補鏈，可分為單鏈和雙鏈探針；根據放射性標記物摻入情況，可分為均勻標記和末端標記探針。下面主要介紹雙鏈DNA探針及其標記方法和光敏生物素標記探針的方法。

(一)切口平移法(nick translation)標記雙鏈DNA探針

當雙鏈DNA分子的一條鏈上產生切口時，E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可將核苷酸連接到切口的3?蒺羥基末端。同時該酶具有從5?蒺→3?蒺的核酸外切酶活性，能從切口的5?蒺端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同時又在切口的3?蒺端補上核苷酸，從而使切口沿著DNA鏈移動，用放射性核苷酸代替原先無放射性的核苷酸，將放射性同位素摻入到合成新鏈中。最合適的切口平移片段一般為50～500bp。

切口平移反應受幾種因素的影響：

① 產物的比活性取決于[α-32P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置換的程度；

② DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的質量會影響產物片段的大小；

③ DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會抑制酶的活性，故應使用仔細純化后的DNA。

1． 材料

（1） 設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。 　　

（2） 試劑： ①10×切口平移緩沖液：0.5mol/L Tris·Cl(pH7.2)；0.1mol/L MgSO4；10mmol/L DTT；100μg/ml BSA。②未標記的dNTP原液：除同位素標記的脫氧三磷酸核苷酸外，其余3種分別溶解于50mmol/L Tris·Cl (pH7.5)溶液中，濃度為0.3mmol/L。③[α-32P]dCTP或[α-32P]dATP 400 Ci/mmol, 10μCi/μl。④ E.coli DNA聚合酶Ⅰ(4U/μl)溶于50μg/ml BSA，1mmol/L DTT，50%甘油，50mmol/L Tris·Cl(pH7.5)中。⑤DNA酶Ⅰ1mg/ml。⑥EDTA 200mmol/L(pH8.0)。⑦10mol/L NH 4Ac。

2． 方法

（1）按下列配比混合：未標記的dNTP 10μl、10×切口平移緩沖液5μl、待標記的DNA 1μg、[α-32P]dCTP或dATP(70μCi) 7μl、E.coli DNA聚合酶4U、DNA酶Ⅰ1μl，加水至終體積 50μl；

（2）置于15℃水浴60min；

（3）加入5μl EDTA終止反應；

（4）反應液中加入醋酸銨，使終濃度為0.5mol/L，加入兩倍體積預冷無水乙醇沉淀回收DNA探針。 　　

3． 注意事項

（1）3H、32P及35S標記的dNTP都可用于探針標記，但通常使用[α-32P]-dNTP。

（2）DNA酶Ⅰ的活性不同，所得到的探針比活性也不同，DNA酶Ⅰ活性高，則所得探針比活性高，但長度比較短。

（二）隨機引物合成法

隨機引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探針。合成產物的大小、產量、比活性依賴于反應中模板、引物、dNTP和酶的量。通常，產物平均長度為400～600個，可以獲得大量的有效探針。反應時對模板的要求不嚴格，用微量制備的質粒DNA模板也可進行反應。反應產物的比活性較高，可達4×109 cpm/μg探針。隨機引物反應還可以在低熔點瓊脂糖中直接進行。

1. 材料

（1）設備：高速臺式離心機，恒溫水浴鍋等。 　　

（2）試劑：①隨機引物（隨機六聚體或斷裂的鮭魚精子DNA）。②10×隨機標記緩沖液：900mmol/L HEPES (pH6.6)；10mmol/L MgCl2。③Klenow片段。④20mmol/L DT。⑤未標記的dNTP溶液：dGTP、dCTP和dTTP溶液，各5mmol/L。⑥[α-32P] dATP：比活性3000Ci/mmol，10μCi/μl。⑦緩沖液A：50mmol/L Tris·Cl（pH7.5）、50mmol/L NaCl、5mmol/L EDTA（pH8.0）、0.5% SDS。

2． 步驟

（1）200ng雙鏈DNA(1μl)和7.5ng隨機引物(1μl)混合后置于Eppendorf管內，水浴煮沸5min后，立即置于冰浴中1min。

（2）與此同時，盡快在一置于冰浴中的0.5ml Eppendorf管內混合下列化合物：20mmol/L DTT 1μl、未標記的dNTP溶液 1μl、10×隨機標記緩沖液 1μl、[α-32P] dATP(比活性3000Ci/mmol；10μCi/μl) 3μl、ddH2O 1μl。

（3）將步驟(1) Eppendorf管中的溶液移到步驟（2）管中。

（4）加入5U(約1μl) Klenow片段，充分混合，在微型離心機中以12000g離心1～2s，使所有溶液沉于試管底部，在室溫下保溫3～16h。

（5）在反應液中加入10μl緩沖液A后，將放射性標記的探針保存在-20℃下備用。同時計算放射比活性。 　　

3． 注意事項

（1）引物與模板的比例應仔細調整，當引物高于模板時，反應產物比較短，但產物的累積較多；反之，則可獲得較長片段的探針。

（2）模板DNA應是線性的，如為超螺旋DNA，則標記效率不足50%。

（三）光敏生物素標記方法

光敏生物素是一種化學合成的生物素衍生物。其分子中含有可光照活化的疊氨代硝苯基。醋酸鹽易溶于水，在水溶液中光敏生物素醋酸鹽與待標記核酸混合，在強可見光短暫照射下即能與核酸的堿基反應，生成光敏生物素標記核酸探針。一般在規定條件下，核酸中每100～150bp可結合一個生物素。這種生物素標記的探針不會影響探針序列與其互補和新的靶序列之間的雜交。該標記方法的優點是簡便易行，單、雙鏈DNA和RNA都能以此法標記形成穩定的共價結合，且生成的標記探針為橙紅色，便于觀察反應結果。此法標記的探針可檢出0.5pg濾膜結合DNA。此外，標記探針穩定性好，-20℃可保存12個月。

1． 材料

（1）儀器　LYQ 12～100鹵鎢燈、臺式離心機。

（2）器皿　微量移液器、Tip頭，光標用冰模、墨鏡、尺子。

（3）試劑　①光敏生物素醋酸鹽為白色干粉，分子量為533。在暗室中用滅菌雙蒸水溶解，使成1mg/ml。小量分裝，避光下-20℃可穩定保存4～6個月。②仲丁醇或正丁醇。③TE緩沖液100 mmol/L Tris·Cl(pH 9.0)1 mmol/L  EDTA。④無水乙醇、70％乙醇。⑤3 mol/L醋酸鈉(pH5.2)。⑥0.1 mmol/L EDTA(pH8.0)或滅菌dH2O。

2．方法

（1）強光源照射標記：在暗室安全燈下，向微量離心管中加入15μg待標記核酸(DNA或RNA)，15μg光敏生物素并混勻。將反應管敞口插入冰模中，液面距光源10cm，用LYQ 12-100鹵鎢燈光照標記30min。加入70μlTE緩沖液。此后操作在正常光線下進行。

（2）仲丁醇提取：加入100μl(等體積)仲丁醇(或正丁醇)，充分混勻，4000g離心2min。吸棄上相，加入等體積仲丁醇(或正丁醇)重復萃取一次。

（3）乙醇沉淀濃縮：吸棄上相，計量下相(溶液可濃縮至40μl左右)。加入1/10體積3mol/L的乙酸鈉(pH5．2)和2倍體積冷無水乙醇，混勻。-20℃沉淀過夜或-70℃沉淀1h以上。以4℃10000g離心15min。棄上清，再用100μl 70％冷乙醇以4℃10000g離心15min。離心洗滌沉淀(注意勿將沉淀吹散)。

（4）標記核酸的保存：真空干燥或室溫風干標記沉淀物，將其溶于適量0.1 mmol/L EDTA溶液或滅菌雙蒸水中。適量分裝后-20℃避光保存備用。

3． 注意事項

（1）避光下準備反應體系：由于光敏生物素醋酸鹽對光敏感，應避免光照。在分裝試劑及核酸與光敏生物素混合時應在暗室安全燈下操作。

（2）核酸純度：由于光敏生物素能與任何有機物反應，因此用做標記探針的核酸要高度純化。用作標記探針的核酸最好不用Tris溶液溶解，Tris中所含氨基會干擾標記。

（3）光照標記時間：光照時間不應太長。如果核苷酸上標記光敏生物素過多，會因空間位阻而影響探針與靶序列的雜交。一般認為，每100～400bp標記上一個光敏生物素分子。此法適用于大于200bp的核酸片段的標記，小片段標記率不高。

（4）光敏生物素用量：光敏生物素的活性基團是堿基，反應中加量不能太多，否則會產生氮氣泡。一般為1 μg DNA用1～2μg光敏生物素。

二、原位雜交

原位雜交（in situ hybridization）用特定標記的已知堿基序列核酸作為探針與組織、細胞中待檢測核酸按堿基互補配對的原則在原位進行特異性結合，形成雜交體，然后用與標記物相應的監測系統，通過免疫組織化學方法在被檢測核酸原位進行細胞內核酸定位。原位雜交可根據檢測物而分為細胞內和組織切片原位雜交；根據其用探針及檢測核酸的不同可分為DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA雜交。根據標記方法不同可分為放射性探針和非放射性探針。

其基本方法包括：固定、切片、雜交、顯色等主要步驟。

(一)取材與標本固定

1． 取材　對于原位雜交所用的材料要盡可能新鮮，為了防止RNA的降解，取材要迅速，取材后要盡快固定或冷凍保存。

2． 固定　進行原位雜交的組織或細胞必須經過固定處理，固定的目的是為了①保持細胞形態原有結構；②最大限度保存細胞內的DNA或RNA的水平；③使探針易于進入細胞或組織內。

3． 固定液　常用固定液有10％甲醛、4％多聚甲醛、冰醋酸-酒精混合液、Bouin氏固定液等。這些固定液都有不同的優缺點因此要根據具體的實驗對象，選擇最佳的固定液。

4． 固定方法　組織標本取材后，迅速放入固定液中2～4h，取材組織大小為1cm×1cm×0.5cm，不宜太大。必要時，動物組織可進行灌流固定，然后將組織按要求取材放入20%蔗糖中，4℃過夜，次日可行冰凍切片。

(二)切片及細胞標本的制備

1． 載玻片的處理　因為原位雜交一般在載玻片上進行，所以載玻片必須保持清潔且不能有任何核酸酶的污染。一般載玻片可先經洗衣粉浸泡過夜，用流水沖洗、酸中浸泡4～8h，再用流水沖洗，雙蒸水洗2～3次。在160℃烤箱中烘烤2～4h。亦可經15磅高壓滅菌20min處理，可將載玻片上的核酸酶消除。

2． 組織切片與預處理

（1）冰凍切片：新鮮組織也可在取材后，直接置入液氮中迅速驟冷，冷凍切片后，4％多聚甲醛固定5～10min，也可保存在-70℃中待用。雜交前切片迅速恢復至室溫并干燥，0.1mol PBS洗三次，2×SSC洗10min，滴加預雜交液室溫孵育1h。

（2）石蠟切片：組織固定后，常規石蠟包埋切片，可長期保存，隨時用于原位雜交。雜交前切片經①二甲苯脫蠟2次，每次10min；②純酒精洗2次，每次5min；③空氣干燥5min；④梯度酒精復洗95％，80％，70％各1min；⑤0.1 mol PBS洗3次，每次5min；⑥2×SSC洗10min；⑦滴加預雜交液于濕盒內室溫孵育1h。

（3）培養細胞：每張載玻片滴加200μl濃度為1×105/m1的細胞懸浮液，空氣干燥1～2min制成細胞涂片，也可直接用培養細胞蓋片。上述細胞片經酒精或多聚甲醛固定5min，其余步驟同冰凍切片。

(三)試劑配制

配制溶液過程中均需戴手套，液體配制均用超凈水，所用瓶子均經160℃烘烤4h，主要目的是去除RNA酶。

1． DEPC水　將DEPC按1‰濃度加入超凈水中，充分混合后靜置過夜，15~20min高壓消毒，之后室溫避塵存放。

2． 0.1mol PBS　pH 7.4

A液：0.1mol NaH2PO4為NaH2PO4 (MW：156.01，2H2O)1.56g；DEPC水100.00m1。

B液：0.1mol Na2HP04為Na2HPO4 (MW：358.14，12H2O)17.907g；DEPC水500.00m1。

A液：B液＝9.5∶40.5 加NaCl使其濃度達0.85％。

3． 20×SSC　為NaCl(3mol/L)8.765g；Na3C6H50H2O7·2(0.3mol/L)4.410g；DEPC水50.00m1。

4． 4％多聚甲醛(pH 7.4)　為多聚甲醛4g；0.1mol PBS100m1。

5． 緩沖液

（1） 緩沖液Ⅰ(pH 7.5)　為1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；消毒超凈水加至1000ml。

（2） 緩沖液Ⅱ(pH 9.5)　為1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超凈水加至1000ml。

（3） 緩沖液 Ⅲ(pH 9.5)　為1mol Tris-HCl 100ml；1molEDTA 5ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超凈水加至1000ml。

6． 去離子甲酰胺　將陰陽離子交換樹脂各5g加入50ml甲酰胺中，待樹脂下沉后用上清液。

7． 50％硫酸葡聚糖　5g硫酸葡聚糖加10ml DEPC水，不斷攪動使之完全溶解。

8． 50×Denhardt's液　為1％Fico11type 400（聚蔗糖）0.2g；1％PVP（聚乙烯砒硌烷酮）0.2g；1％BSA（牛血清白蛋白）0.2g；DEPC水 20.0ml。

9． 預雜交液　為去離子甲酰胺5.0m1；20×SSC2.0m1；鮭魚精DNA (10mg/m1) ；0.5ml（沸水變性10min）；酵母tRNA (10mg/m1)0.25m1；50％硫酸葡聚糖2.00m1；50×Denhardt?蒺s液 0.20ml。

(四)雜交與顯色

1．雜交　將已標記的探針加入預雜交液即成為雜交液（探針濃度為1μg/m1），切片經2×SSC短暫浸洗后，滴加雜交液，于濕盒內置37℃或42℃孵育過夜。然后依次經2×SSC室溫浸洗1h，l×SSC室溫浸洗lh，0.5×SSC37 ℃浸洗30min，0.5×SSC室溫浸洗30min。注意滴加雜交液時切片勿干燥。

2． 顯色　以下各步均在室溫下進行。

（1）緩沖液I洗1min。

（2）用含2%正常羊血清和0.3％TritonX-100的緩沖液I孵育切片30min。

（3）用含1％正常羊血清和0.3％TronX-100的緩沖液I稀釋羊抗Dig抗體。

（4）將抗體稀釋液滴加在切片上，封口膜覆蓋，濕盒內4℃孵育過夜。

（5）緩沖液I洗10min。

（6）緩沖液Ⅱ洗10min。

（7）加顯色液，封口膜覆蓋，避光室溫孵育2～20h，隨時鏡檢，當顯色滿意時入緩沖液Ⅲ終止顯色。

顯色液臨用前配，其配方為：①NBT 45μl；②X-Phospllate液 35μl；③左旋咪唑      2.4mg；④緩沖液Ⅱ 加至10ml。

（8）常規脫水、透明、封固。

結果：雜交陽性信號為紫藍色顆粒。

(五)原位雜交對照試驗

同免疫組織化學染色對照一樣，為證明原位雜交實驗操作的準確性和實驗結果的特異性，需要設置一系列對照實驗，具體的各種對照實驗的設置及其意義請參考原位雜交專著，以下僅介紹幾種常用的對照實驗。

1． 省去標記探針　在做原位雜交時，以PBS或預雜交液替代雜交液，結果應為陰性，這是一種簡便而有意義的陰性對照實驗。如省去標記探針仍出現陽性反應，這一定是假陽性。

2． 自身對照　用同一組織切片或涂片上與靶序列無關的其他結構作對照。陽性與陰性結構同在一個視野中，相互印證，這本身就是對陽性反應的特異性對照。

3． 陰性對照　用已知不存在相應靶序列的組織標本雜交，結果應為陰性。陰性對照可排除在雜交過程中由于非特異性雜交反應等因素造成的假陽性結果。

4． 陽性對照　用已知含靶序列的組織切片與待檢標本同樣處理，結果應為陽性，稱陽性對照。通過陽性對照可證明雜交過程中各個步驟以及所使用的試劑都合乎標準，實驗方法可靠。尤其當待檢標本為陰性時，陽性對照片呈陽性反應可排除待檢標本假陰性的可能。故若預期雜交結果為陰性時，就必須設陽性對照，當陽性對照亦不顯色，就證明雜交過程的某一步驟或所用試劑問題。