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    發布時間:2021-08-27 20:45 原文鏈接: 核酸鑒定方法之濃度

    核酸純化在分子生物學實驗室已經廣泛應用。怎樣獲得高質量、高純度的DNA或RNA樣品對下游實驗的順利進行至關重要,因此,對純化后的核酸進行鑒定也是*的步驟。本文簡單的回顧學習一下核酸鑒定的方法。
    核酸鑒定包括:濃度/純度鑒定+完整性鑒定
     
    1.濃度/純度鑒定
     
    (1)紫外分光光度計:
    原理:由于核酸中的堿基都具有共軛雙鍵,所以具有紫外光吸收性質。核酸在紫外光譜區有一條典型的吸收曲線,其吸收高峰在260nm處,吸收低谷在230nm處。蛋白質在紫外區的吸收高峰在280nm處,所以核酸的紫外吸收光譜數據是鑒定核酸的重要依據之一。

    由于核苷酸zui大吸收波長為260nm,根據朗伯-比爾定律可計算出在波長260nm的紫外線下,1個OD值的光密度大約相當于50μg/ml的雙鏈DNA, 40μg/ml的單鏈RNA。紫外分光光度法只適用于測定濃度大于0.25μg/ml的核酸溶液。
     
    計算公式:
    dsDNA(μg/μl)=OD260x50x稀釋倍數/1000
    RNA(μg/μl)=OD260x40x稀釋倍數/1000
     
    純凈的DNA OD260/OD280=1.8,制備的樣品DNA比值在1.7-1.9,若洗脫時不使用洗脫緩沖液而使用去離子水,比值會偏低,因為PH值和離子存在會影響光的吸收值。

    當OD260/OD280< 1.7,表明蛋白質含量較高,可用利用酚、異戊醇抽提,再用乙醇沉淀去除。
    當OD260/OD280> 2.0,表明RNA含量較高。可用RNaseA消化后再進行純化。
    OD260/OD230的值,一般不小于2.0,若小于2.0,表明有碳水化合物、鹽類或有機試劑污染。
     


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