桔梗提取物中桔梗皂苷D的反相高效液相色譜檢測方法

【摘要】 目的建立桔梗提取物中桔梗皂苷D的高效液相色譜（HPLC）檢測方法。方法采用RP－HPLC法、蒸發光散射檢測器（ELSD）測定桔梗皂苷D含量。色譜柱為Agilent ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈∶0.5％乙酸溶液＝28∶72，流速1.0 ml/min；檢測器為Waters ELSD 2420。結果桔梗皂苷D在0.015 625～0.25 mg/ml范圍內與峰面積具有良好的線性關系，r=0.999 6。桔梗皂苷D平均回收率為98.25％，RSD為1.18％。結論通過6批不同的桔梗提取物的含量測定，證明該方法簡便、準確、可靠。

　　【關鍵詞】 桔梗提取物； 桔梗皂苷D； 反相高效液相色譜法； 蒸發光散射檢測

　　Abstract：ObjectiveTo establish an RP-HPLC determination method of the platycodin D in Platycodon Grandiflorum extracts. MethodsPlatycodin D content was detected by high performance liquid chromatogram-ELS Detector（HPLC－ELSD）. Agilent Hypersil ODS (4.6 mm×250 mm，5 μm) was used , mobile phase was V (acetonitrile)∶V (0.5％acetic acid)=28∶72 at 1.0 ml/ min speed. ELSD2420 detector was used for qualitative and quantitative analysis in external standard method.ResultsPlatycodin D has good linear relation in 0.015625 mg/ml－0.25 mg/ml. r=0.9996. The recovery of platycodin D was 98.25%, RSD was 1.18%. ConclusionThe content of platycodin D in six different groups of samples is determined. The obtained results indicate that this method is simple, accurate, and credible.

　　Key words：Platycodon grandiflorum extracts； Platycodin D； HPLC-ELSD； Analytic method

　　在我國，以中藥材為原料的中藥提取物被用于醫療或保健食品已形成了一定的生產規模。規范中藥提取物的質量對中藥產業的發展至關重要，大量中藥提取物還有待制訂國家標準或行業標準［1］。

桔梗提取物具有多種生物活性和很好的藥用價值［2］，是市場暢銷的中藥提取物之一，但現無嚴格的質量標準。桔梗總皂苷是桔梗提取物的主要藥效成分，其中桔梗皂苷D含量最高，藥效較確定［3］。

2005年版《中國藥典》中桔梗藥材是以總皂苷為指標，采用重量法測定總皂苷含量［4］，精確性較低。許傳蓮等［5～7］用高效液相色譜紫外檢測器檢測桔梗藥材中桔梗皂苷D，但桔梗皂苷D 無共軛結構,無強的發色基團,末端吸收檢測干擾較大。

目前尚沒有報道檢測桔梗提取物中桔梗皂苷D的相關文獻。本文以桔梗皂苷D為指標，采用HPLC-ELSD為檢測方法，對桔梗提取物中的桔梗皂苷D進行了分析研究。

　　1 儀器與試藥

　　1.1 儀器：Waters高效液相色譜儀［Waters515高壓泵，Waters2420蒸發光散射檢測器（ELSD），Empower數據處理系統］，SIGMA 3K15型離心機，Mettler Toledo AG135型電子天平，SC5202型超聲波清洗器。

　　1.2 試藥桔梗藥材由亳州濟人藥業有限公司提供。桔梗提取物由本中心按擬議中的標準生產工藝制備。桔梗皂苷D對照品購于吉林農業大學藥學院。乙腈為色譜級，水為重蒸水。

　　2 方法與結果

　　2.1 色譜條件色譜柱為Agilent Hypersil ODS柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈∶0.5％乙酸＝28∶72，柱溫為25℃，流速1.0 ml/min。ELSD參數：霧化器溫度36℃，漂移管溫度75℃，載氣壓力25psi。理論塔板數按桔梗皂苷D峰計算應不低于3000，桔梗皂苷D的峰與其他峰能達到基線分離，且出峰時間適宜，峰形較好。

　　2.2 對照品溶液的制備精密稱取干燥至恒重的桔梗皂苷D對照品2.5 mg，置10 ml容量瓶中，加乙腈∶0.5％乙酸(28∶72)溶液至刻度，搖勻，即得0.25 mg/ml的對照品溶液。

　　2.3 供試品溶液的制備取桔梗提取物干粉50 mg，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，加甲醇約50 ml，超聲處理（功率250W，頻率40kHz）30 min，過濾，濾液蒸干，用適量水溶解，然后用乙醚萃取1次，棄去醚層，水層用水飽和正丁醇萃取3次，合并醇液，蒸干，用5ml甲醇復溶，溶液離心處理（10 000 r/min，10 min），微孔濾膜過濾，取濾液，即得。

　　2.4 線性關系的考察精密吸取對照品溶液逐級稀釋成0.25，0.125，0.0625，0.03125，0.015625 mg/ml 5個不同濃度的對照品溶液，按上述條件進樣，進樣量10 μl/次，測定其峰面積，然后以桔梗皂苷D濃度的自然對數為橫坐標，峰面積的自然對數為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為Y＝1.233X+13.443，r=0.999 6；實驗結果表明桔梗皂苷D的濃度在0.015 625～0.25mg/mL范圍內與所測得的相應峰面積呈良好的線性關系。

　　2.5 精密度實驗精密吸取0.0625mg/ml的對照品溶液10μl進樣，重復進樣6次，按上述色譜條件測定桔梗皂苷D的峰面積分別為22 561，22 108，22 235，22 463，22 412，22 369。RSD＝0.73％。結果表明本方法的精密度良好。

　　2.6 穩定性實驗精密吸取供試品溶液，按上述色譜條件，每隔2 h進樣1次，共進樣6次，桔梗皂苷D的峰面積分別為30 938，32 535，31 427，31 656，32 009，30 786。RSD＝1.58％。結果表明，桔梗皂苷D的峰面積在10 h內無明顯變化，供試品溶液穩定性好。

　　2.7 重復性實驗取同一批樣品，用“2.3”項的方法處理，平行試驗6次，測得桔梗皂苷D的含量為0.086 6，0.086 2，0.087 5，0.085 1，0.083 9，0.087 7 mg/ml。RSD＝1.72％。結果表明，在同一條件下，6次測得樣品桔梗皂苷D含量一致，本方法重復性好。

　　2.8 回收率試驗采用加樣回收法，精密稱取已知含量的樣品6份，每份0.5g，精密添加桔梗皂苷D對照品3 mg，按“2.3”項下的方法制成樣品溶液，取10 μl進樣，測定桔梗皂苷D的含量。計算平均回收率為98.25％，RSD＝1.18％。結果見表1。結果表明，本方法回收率好。

　　表1 加樣回收率試驗結果（略）

　　2.9 樣品含量測定按“2.3”項的方法制備樣品，用上述方法對以下不同批次的桔梗提取物進行含量測定。結果見表2。

　　表2 桔梗提取物中桔梗皂苷D含量測定結果（略）

　　3 討論

　　通過改變ELSD的參數及流動相的組成與配比，最終選定漂移管溫度：75℃；載氣壓力25psi。霧化器溫度：36℃；流動相用乙腈∶0.5％乙酸＝28∶72。較文獻［8］用乙腈∶水＝28∶72增大了桔梗皂苷D峰的響應值，提高了桔梗皂苷D的檢測限。同一樣品使用兩種不同流動相時色譜圖比較，見圖1和圖2。

　　桔梗多糖在提取及分離過程中部分被去除，含量降低，但是仍然影響測定結果，因此在前處理過程中用水飽和正丁醇萃取除糖，排除了桔梗多糖峰的影響。

　　由于桔梗皂苷D只有一個C=C雙鍵，紫外吸收弱，且末端吸收在203nm有較大的干擾。選用HPLC-ELSD，可以避免以上問題，提高檢測的精密度，見圖3和圖4。

　　本實驗結果為桔梗提取物質量標準的制定提供了可供參考的分析方法。

　　【參考文獻】

　　［1］ 徐為公，徐 鵬.中藥提取物的國際化策略［J］. 中藥研究與信息，2005，7（10）：34.

　　［2］ 付文衛，竇德強，裴月湖.桔梗的化學成分和生物活性研究進展［J］. 沈陽藥科大學學報，2006，23（3）：184.

　　［3］ 肖崇厚.中藥化學［M］.上海：上海科學技術出版社，1997：419.

　　［4］ 國家藥典委員會.中國藥典，Ⅰ部［S］，2005：196.

　　［5］ 許傳蓮，鄭毅男，楊臘虎，等. HPLC法測定不同采收期及不同部位桔梗中桔梗皂苷D含量［J］.吉林農業大學學報，2001，23（1）：58，64.

　　［6］ 郭 麗，肖永慶，張 村，等. 桔梗藥材中桔梗皂苷D的定性定量方法研究［J］.北京中醫藥大學學報，2007，30（3）：200.，209.

　　［7］ 石俊英，王 穎，鞏麗麗，等. HPLC法測定桔梗不同部位、不同產地藥材中桔梗皂苷D含量［J］.山東中醫藥大學學報，2007，31（6）：501.

　　［8］ 朱丹妮，舒 孌，郅 慧，等.HPLC－ELSD 法測定桔梗中桔梗皂苷D的含量［J］.植物資源與環境學報，2001，10（4）：11.