梅毒常見實驗室診斷方法及其進展

摘要 近年來梅毒的發病率有逐年增加的趨勢、研究新的快速、價廉、簡便、敏感且特異的診斷方法是當前主要研究熱點，而設計新試劑盒的關鍵在于，對現有試劑盒優、缺點的認識和改良，利用人工合成梅毒螺旋體原設計出新的檢測方法。對梅毒螺旋體抗原的分析及人工合成，國外早在1989年就已開始進行，幾年來發展迅速，目前已有各種針對不同需要的試劑盒。

關鍵詞 梅毒 血清學診斷 合成抗原

　　目前雖然各國之間梅毒流行的情況送別很大，但它依舊是十分重要的社會和醫學問題[1]。近年來，大多數歐洲國家梅毒發病率顯著下降，已小于2/10萬。但在前蘇聯國家中，梅毒的發病率卻顯著上升，如俄羅斯梅毒的發病率大于32/10萬[2]。即使在美國，在特定的種族人群中梅毒的發病率依然很高[3]。在我國，梅毒的發病率逐年增多，所以研究新的快速、價廉、簡便、敏感且特異的診斷方法，對該病的防治有著重要的意義。現對目前已有診斷方法的優缺點，以及最新診斷方法作一綜述。

梅毒常用診斷方法

　　（一）檢查梅毒螺旋體：可用病損處的滲出液進行暗視野、涂片銀染色、免疫熒光染色、家兔感染試驗（RIT）或PCR法檢測，以及用酶免疫法（EIA）理論設計的，利用單克隆抗體檢驗梅毒螺旋體的方法，如Visuwell試驗[4]。①暗視野顯微鏡檢查由于對取材、檢查技術要求較高；并且在口腔及肛門部位有口腔螺旋體、大齒密螺旋體、小齒密螺旋體及生殖器螺旋體等其他條件致病螺旋體存在，暗視野檢查時不易與它們區分；此外梅毒螺旋體本身很脆弱，容易受外界條件如服用過抗生素、病損處外用一些化學藥物等的影響，該方法敏感性較低，所以暗視野檢查陽性也不能排除梅毒的可能性。但由于它特異性很高，經過訓練的檢驗人員在暗視野顯微鏡下看到形態典型的梅毒螺旋體，結合臨床癥狀即可作出早期診斷。②鍍銀染色法檢查螺旋體，適用于缺乏暗神顯微鏡的基層單位。③免疫熒光染色是用抗梅毒螺旋體抗血清或單克隆抗體，加非致病性螺旋體培養物進行吸收，再與異硫氰酸熒光素（FITC）相結合，用此方法來染梅毒螺旋體，在熒光顯微鏡下讀結果，陽性者可見綠色熒光螺旋體，其優點是可區分梅毒螺旋體與其他條件致病性螺旋體，對口腔、肛門等部位的損害有鑒別價值，且敏感性亦有所提高。④RIT是利用家兔對梅毒螺旋體的易感性，把梅毒螺旋體注射于成年新西蘭白兔睪丸內，觀察有無感染亦象。RIT是經典的梅毒診斷方法，由于其費用高、檢查時間長等弊病目前僅用于科學研究。⑤PCR法是較新的方法，它能對生殖器潰瘍早期鑒別診斷，區分梅毒、生殖器皰疹及軟下疳[5]。它可分為PCR和RTPCR，PCR的設計主要針對編碼梅毒螺旋本特異性抗原和TpN47（Tpp47）的DNA開放編碼區，常見的引物設計見附表。

　　由于在PCR中會偶然出現非特異的PCR產物而干擾結果，這就必須用特異性的DNA探針進行DNA-DNA雜交來提高PCR的特異性及敏感性。此外用TpN47設計的PCR，由于TpN47的保守性，雅司螺旋體可產生類似的PCR產物，所以這種設計的PCR不能區分梅毒和雅司；但可以區分梅毒螺旋體和引博氏疏螺旋體，這就可以解決梅毒與萊姆病之間血清診斷中的免疫交叉問題[6]。另一種是RT-PCR，常見的設計是針對梅毒螺旋體的16s rRNA 366bp片段[7]，這種方法污染少，特異性敏感性高，但價格稍高。PCR在梅毒持續感染中的診斷價值目前尚無一致意見，理論上PCR可查出死亡的TP，所以治療后PCR陽性并不意味著治療失敗，但死亡的TP從機體內清除較快（15～30天），而存活的TP從機體內清除至少需120天，所以治療數周后PCR陽性意味著持續感染的可能[8]。

附表：針對編碼梅毒螺旋47-kD抗原基因設計的常用引物起萊姆病的

　　（二）梅毒血清試驗：梅毒螺旋體感染機體后可產生兩種抗體，一種是抗心磷脂抗體，即非特異性抗體，亦稱反應素，主要方法有性病研究實驗室試驗（VDRI）、血清不需加熱的反應素試驗（USR）和快速血漿反應素環狀卡片試驗（RPR）以及Capture-S試驗——一種非螺旋體抗體因相紅細胞吸附試驗[9]。這種抗體滴度與梅毒活動有關，臨床上主要用于觀察療效，復發及再感染。另一種是抗梅螺旋體抗體，即特異性抗體，主要有IgM和IgG檢測方法有熒光螺旋抗體吸收試驗（FTA-ABS）及梅毒螺旋體血凝試驗（TPHA），以及利用螺旋體天然抗體原依照EIA原理設計的Captia select Syph-G試驗[10]，和新近出現的利用梅毒螺旋體合成抗原（TpH15、TpN17、TpN47）設計的ICE syphilis EIA試驗和Syphilis Fast試驗[12]。這些方法一般用于梅毒的確認試驗，由于檢測的是抗梅毒螺旋體IgG抗體，所以即使患者經足夠的抗梅毒治療，血清反應仍保持陽性。而近年來發展的檢測抗梅毒螺旋體IgM抗體，卻能早期診斷及判斷療效。主要方法有：①19S-IgM-熒光抗體吸收試驗（19S-IgM-FTA-ABS）:先用高壓液相色譜或其他方法分離標本中的IgM，然后再做FTA-ABS，其特異性與敏感性均很高，但價格昂貴不易推廣。②IgM固相血凝試驗（IgM-SPHA）和梅毒螺旋體特異性IgM血凝試驗（TP-IgM-HA）均是對現有方法的改良，要求事先分離IgM抗體。③梅毒特異性IgM抗體捕捉ELISA試驗（IgM-CAP-ELISA）[13]:此方法是利用間接ELISA的原理，擾抗人IgM單抗包被在微量滴定板或其它固相載體上，加入待檢血清以捕捉其中的IgM，再先后加入超聲粉碎或基因重組獲得的梅毒螺旋體抗原、生物素標記的抗梅毒螺旋體單抗、辣根過氧化物酶標記的鏈親和素及底物，最后通過顯色判定結果。④SDS-PAGE及免疫印跡法：把梅毒螺旋體溶解后的懸液或Triton x-114提取液，點于SDS-多聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電泳后轉移至硝酸纖維膜上，分別加入等檢血清、辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgM或IgG抗體、底物4-氯萘酚，當出現72、47、45、42、37、17、15kD中的一條或多條顯色帶即判定為陽性[14]。由于梅毒感染后血循環中首先產生的是IgM抗體，并且IgM抗體不能通過胎盤，而且梅毒患者抗TPIgM抗體的出現與梅毒的復發再感染或活動性有關，所以IgM抗體檢測試驗是早期梅毒、胎傳梅毒診斷和療效觀察的十分敏感和特異的方法，通過檢測抗TP igM抗體可提示是梅毒活動還是靜止以及是否需要治療等。

　　既往設計的酶聯免疫試劑盒采用的是梅毒螺旋體Nichol株的天然提純抗原，如Select syph-C。這種試驗的缺點在于天然提純抗原成分復雜，并且不能非常快速地得到結果，所以用分子克隆技術，人工合成梅毒螺旋體抗原是設計新試劑盒的關鍵，因為它能克服制備天然抗原時不可避免的兔蛋白污染，并且成分清晰固定，而且可以利用ELISA的全自動化、金標紙片法的快速化設計成各種試劑盒。