植物體內可溶性蛋白質含量的測定:LoWry法(勞里法)

【原理】

LoWry法是雙縮脲法(BIureT)和福林酚法(ＦolIn－酚)的結合與發展。其原理是蛋白質溶液用堿性銅溶液處理后，堿性銅試劑與蛋白質中的肽鍵作用產生雙縮脲反應，形成銅—蛋白質的絡合鹽。再加入酚試劑后，在堿性條件下，這種被作用的蛋白質上的酚類基團極不穩定，很容易還原酚試劑中的磷鎢酸和磷鉬酸(PHosPHoMolyBdATe ＆ PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷鎢藍和磷鉬藍的混合物。這種溶液藍色的深淺與蛋白的含量成正相關，所以可以用于蛋白質含量的測定。LoWry法除使肽鏈中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等顯色外，還使雙縮脲法中肽鍵的顯色效果更強烈，其顯色效果比單獨使用酚試劑強3～15倍，約是雙縮脲法的100倍。由于肽鍵顯色效果增強，從而減少了因蛋白質種類不同引起的偏差。LoWry法適于微量蛋白的測定，對多個樣品同時測定較為方便。但對不溶性蛋白和膜結合蛋白必須進行預處理(如加入少量的SDS)。

1.雙縮脲法的原理雙縮脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在堿性溶液中可與銅離子產生紫紅色的絡合物，這一反應稱為雙縮脲反應。因為蛋白質中有多個肽鍵，也能與銅離子發生雙縮脲反應，且顏色深淺與蛋白質的含量的關系在一定范圍內符合比爾定律，而與蛋白質的氨基酸組成及分子量無關，所以可用雙縮脲法測定蛋白質的含量。

雙縮脲反應主要涉及肽鍵，因此受蛋白質特異性影響較小。且使用試劑價廉易得，操作簡便，可測定的范圍為1～10Mg蛋白質，適于精度要求不太高的蛋白質含量的測定，能測出的蛋白質含量須在約05Mg以上。雙縮脲法的缺點是靈敏度差、所需樣品量大。干擾此測定的物質包括在性質上是氨基酸或肽的緩沖液，如TrIs緩沖液，因為它們產生陽性呈色反應，銅離子也容易被還原，有時出現紅色沉淀。

2.福林-酚法的原理　該方法是雙縮脲法的發展，包括兩步反應：

(1)在堿性條件下，蛋白質與銅作用生成蛋白質—銅絡合物。

(2)此絡合物將試劑磷鉬酸—磷鎢酸(ＦolIn試劑)還原，混合物深藍色(磷鉬藍和磷鎢藍混合物)，顏色深淺與蛋白質含量成正比。此方法操作簡便，靈敏度比雙縮脲法高100倍，定量范圍為5～100μg蛋白質。ＦolIn試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物，均有干擾作用。此方法的缺點是有蛋白質的特異性影響，即不同蛋白質因絡氨酸、色氨酸含量的不同而使顯色強度稍有不同，標準曲線也不是嚴格的直線形式。

【 儀器 與用具】

試管若干；刻度移液管05Ml 1支，1Ml 1支，10Ml 1支；定量加樣器；圓底燒瓶；冷凝管1套(帶橡膠管)；微量滴定管；小燒杯；微量進樣器50μl 1支；721分光光度計；恒溫水浴器；研缽；玻棒；離心機；離心管。

【 試劑 】

NA2WO4·2H2O；NA2MoO4·2H2O；85％H3PO4；濃HCl；LI2SO4·H2O；溴水；酚酞指示劑；NA2CO3；NAOH；CuSO4·5H2O；酒石酸鉀鈉；牛血清白蛋白。所用 試劑 均為化學純或分析純。