2. 在平板儀器上進行 IPG-IEF ( Multiphor ll Unit)
滿足下列條件時，水化后的 IPG 膠條可以直接放在 IEF 儀器的冷卻板上：① 如果運行時間不超過 12 h ( 經常發生在寬的或中等 pH 范 圍 IPG，如 IPG 3~10 或 4~7 ) 。② 如果 pH 梯度不超 過 pH 10. 0。③ 如果只用杯上樣的方法加很小體積的樣品 ( 20 μl ) [ 3，22 ]。使用 Immobiline 干膠條試劑盒中的上樣杯更方便進行大體積的樣品上樣( 直至 100 μl )。當用干膠條試劑盒進行 IEF 時，IPG 膠條可以用硅樹脂油或干膠條覆蓋油覆蓋。當樣品為極端堿性（pH > 10.0 ) 蛋白質或用窄 pH 梯度（ pH 范圍< 1 單位）進行微量制備電泳時必須用覆蓋油等覆蓋；而當 pH 范圍較寬且 pH 梯度不超過 pH 10.0 ( 如 IPG 4~7 或 3~10 ) 時，使用干膠條試劑盒時可不加覆蓋油。
( 1 ) 將冷卻盤放入 Multiphor ll 電泳儀中。吸取 3~4 ml 煤油或 IPG 干膠條覆蓋油加在冷卻盤上，然后將 Immobiline 干膠條盤放在冷卻盤上（圖 13-2)。在膠條盤和冷卻盤之間避免產生氣泡。
( 2 ) 將膠條盤上的電極連至 Multiphor II 電泳儀上。
( 3 ) 將 10 ml 左右的 IPG 干膠條覆蓋油或硅樹脂油注入膠條盤中，將波紋狀的 Immobiline 膠條標尺放在膠條盤中的覆蓋油的頂端。
( 4 ) IPG 膠條水化后（見 13. 3.1 節 1.1)，用干凈的鑷子從水化盤中取出水化好的 IPG 膠條。用去離子水沖洗膠條，然后將膠條放在兩層濕潤的濾紙之間，用濾紙吸膠條上多余的覆蓋油幾秒。這樣能夠防止 IEF 過程中尿素在膠表面結晶。轉移水化后的 IPG 膠條（膠面朝上且酸性端對準陽極）放入槽中并靠近標尺。排列 IPG 膠條并保證對著陽極的膠條邊緣排列整齊。
( 5 ) 切取兩條 IEF 電極條（GE Healthcare ) 或由厚 2 mm 的濾紙（如 MN440，Macherey Nagel，Germany ) 制成的濾紙條，其長度為所有 IPG 膠條在膠條盤中排列的相應寬度。用去離子水浸泡電極條，再用濾紙吸走多余液體，然后將濕潤的 IEF 電極條放在排列整齊的膠條的陰極和陽極附近。
( 6 ) 將電極放在 IEF 電極條上并輕輕向下按壓電極。
( 7 ) 如果樣品已經在水化時進入膠條，則用約 80 ml 干膠條覆蓋油覆蓋膠條，然后轉至第 12 步。如果用杯上樣方法，則繼續第 8 步。
( 8 ) 將上樣杯放入上樣杯槽中，但要避免接觸膠條表面。而且，確保上樣杯與陽極 ( 或陰極，如果使用陰極上樣）之間有幾毫米的距離。
( 9 ) 將上樣杯移動至合適位置，每個膠條上一個上樣杯，然后輕輕向下壓上樣杯。上樣杯要和膠條緊密接觸但不能損壞膠條表面。
( 10 ) 放好上樣杯之后，向膠條盤中注入約 80 ml 的干膠條覆蓋油以完全覆蓋 IPG 膠條。如果覆蓋油漏入上樣杯，吸出覆蓋油，重新調整上樣杯，再次檢查是否漏液。在每個上樣杯中加入幾滴干膠條覆蓋油。如果使用 pH 為 3~ 10 的寬 pH 梯度進行 IEF，加覆蓋油這一步可以省略。
( 11 ) 吸取樣品并加人覆蓋油下的上樣杯底部。再次檢查是否漏液。
( 12 ) 關閉等電聚焦箱的蓋子，根據表 13-1中的參數開始電泳。為使樣品更好地進入膠內，最初幾小時的電壓應被限制在 150V 、300V、600V。然后用最大電壓 3500V 電泳至穩態（見注釋 4) 。電流限制在 0.05 mA/IPG 膠條。最佳聚焦溫度是 20°C [ 26] 。
( 13 ) 當 IEF 結束后，從膠條盤中取出電極、上樣杯槽和 IEF 電極條。用干凈的鑷子從膠條盤中取出 IPG 膠條。如果 IPG 膠條不被立刻用來進行第二向電泳和（或）用來進一步研究，可將它們夾在兩層塑料膜之間貯存在 -70°C，可貯存數月。
3. 使用 IPGphor 電泳儀進行 IPG-IEF
使用一種叫做 IPGphor ( GE Healthcare，最近 Bio-Rad 也開發出一套類似的系統）的整體系統可使雙向電泳中的 IPG-IEF 簡化 IPGphor 包括一個可精確控溫（在 19.5~20.5°C ) 的 Peltier 元件和一個可編程的電源。這個儀器的核心部分是不同長度的（7cm、11cm、13cm、18cm 或 24cm) 氧化鋁陶瓷制的細槽，被稱為持膠槽。IPG 膠條可在持膠槽中水化并同時上樣，然后進行 IEF。當膠條被放入持膠槽后，后續步驟無需對膠條進行進一步操作（圖 13-2)。IPGphor 是可編程的，而且最多可以存儲 10 組不同程序。該儀器支持延遲啟動，這使得使用者可以在下午在持膠槽中用含有樣品的水化液水化膠條，然后晚上 IEF 自動啟動并在第二天早上結束。
當在堿性 pH 范 圍內（＞ pH 10.0 ) 進行蛋白質分離時，用杯上樣的方法單獨對不同的水化好的 IPG 膠條上樣比用水化上樣的方法上樣得到的分離效果好得多。可以使用特殊杯上樣（“ 通用” ）IPGphor 持膠槽，或復合式杯上樣持膠槽（“ 復合式” ）進行樣品的杯上樣（圖 13-2)。杯上樣最多允許上 100 μl 樣品（見注釋 3) 。持膠槽平臺能夠調節溫度并能將持膠槽與電源連接。除了操作簡單外，IPGphor 的另一個優勢是聚焦時間短。這是因為用 IPGphor 能在很髙的電壓下（最高 8000 V ) 進行 IEF。
使用 IPGphor 進行 IEF 的典型工作條件見表13-2和 表 13-3 。正如前文指出的那樣 ，為了使高分子質量的蛋白質更好地進入聚丙烯酰胺膠內，水化時應在膠條兩端加低電壓（30~50 V ) ，否則將給水化上樣造成困難[ 15，28] 。然后電壓逐步升高至 8000 V。如果 IPG 膠條的分離長度 < 11 cm，電壓應限制在 5000 V 內。為在分離含鹽量高的樣品或使用窄 pH 間隔分離樣品時得到最佳效果，在電壓升髙至 8000 V 之前可在電極和 IPG 膠條之間墊上濕潤的濾紙片（尺寸：4mm X 4mm