3.3 第二向：多重垂直 SDS-PAGE
SDS-PAGE 可以在水平或垂直系統上進行 [29] 。水平設備適用于預制膠（ExcelGel SDS；Amersham Biosciences/ GE Healthcare) 。而垂直系統則應用于多塊膠平行進行的電泳中，尤其是大規模的蛋白質組分析中。這種分析通常需要同時進行數批第二向 SDS-PAGE 電泳以達到更高的通量和最好的重復性 [31] 。
1. 灌制 SDS 膠
( 1 ) 灌膠膠板（200 mm X 250 mm) 由兩塊書本形狀的 3 mm 厚的玻璃板組成。兩塊玻璃板用一根鉸鏈條連接，玻璃板之間有兩條 1 mm 厚的邊條。將 14 塊膠板垂直堆入 Ettan Dah II 的灌膠模具中。堆疊時鉸鏈條朝右，膠板之間用塑料分隔片（如 0.05 mm 厚聚酯片）分隔。
( 2 ) 將灌膠模具的前板放好，旋上螺帽（用手擰緊）（圖 13-2)。
( 3 ) 用環架將一個漏斗支撐在灌膠模具頂端上方約 30 cm 處，用一根聚乙烯管（內徑 5 mm ) 與之連接。管的另一頭與灌膠模具一邊的側室上的金屬接口相連。
( 4 ) 向側室中灌入 100 ml 指示劑。
( 5 ) 在即將灌膠之前，在凝膠溶液中加入 TEMED 和過硫酸氨溶液（表 13-5)。灌膠時，將凝膠溶液（830 ml) 注入漏斗。管中避免產生氣泡。不要用丙烯酰胺溶液將膠板灌滿。這是由于用熱瓊脂糖將 IPG 膠條固定在 SDS 膠頂端時需要一定的空間（約 10 mm)。
( 6 ) 當溶液注入之后，將管從側室接口上取下。此時側室中指示劑的水平面會下降。
( 7 ) 小心地向每塊膠的頂端加入約 1 ml 覆蓋液以使膠面平整光滑。
( 8 ) 讓凝膠在約 20°C 聚合至少 3 h，為獲得更好的重復性，最好過夜聚合。
( 9 ) 膠聚合后，將灌膠模具的前板取下，小心地從模具中取出膠板。可用刀片將膠板分開。將膠板之間的分隔片取下。
( 10 ) 用水清洗膠板以除去膠板外表面的丙烯酰胺，然后將多余液體從膠上端排出。由于電泳一次只能用掉 12 塊膠板，應丟棄不理想的膠板，尤其是厚度不均勻的膠板。通常是外側的膠板。
( 11 ) 如果聚合好的凝膠不被立即使用，可將它們用塑料包好貯存在冰箱中（4°C )。最長可貯存 2 天。
2. 使用 Ettan Dalt II 垂直電泳槽進行多重 SDS-PAGE
( 1 ) 向 Ettan Dalt II 電泳槽下槽中加入 1875 ml 電極緩沖液儲液和 5625 ml 去離子水。混合并打開冷卻器（25°C)。
( 2 ) 將 DALT 膠板（內有 SDS 凝膠）垂直放置在膠板架上以便放上 IPG 膠條。
( 3 ) 用電極緩沖液（用水 1 : 1 稀釋）短暫沖洗平衡好的 IPG 膠 條，將膠條放在 DALT 膠板頂端。
a. 用薄刮刀或尺子推 IPG 膠條背后支持膜，使膠條進入兩層玻璃板之間的空隙中。
b. 加入 2 ml 熱（75°C ) 瓊脂糖溶液，繼續將膠條向下推向 SDS 膠表面直到兩者緊密接觸。IPG 膠條和 SDS 膠表面之間避免產生氣泡。
c. 如需在電泳同時加入分子質量標準蛋白質，可用 5 μl 溶有 SDS 標準蛋白質的電極緩沖液浸泡一張濾紙片（2~4 mm2 ) 。弄干濾紙片后將其放在 IPG 膠條的左側或右側。
d. 干燥后的溶有分子質量標準蛋白質的濾紙片可放在微量離心管中貯存于 -70°C。
( 4 ) 在將膠板放入電泳設備（見第 5 步）之前讓瓊脂糖凝固至少 5 min。對剩余 IPG 膠條重復上述步驟。雖然將膠條埋入瓊脂糖并不是必須的，但這樣做能保證 IPG 膠條和 SDS 凝膠頂端結合更緊密。
( 5 ) 將膠板浸入電極緩沖液使其外側濕潤以便放入電泳槽時更容易。將膠板插入電泳槽中。如有必要，在電泳槽中空著的狹槽中放入空的膠板。將上槽穿過膠板放好，并在其中加入 2.5L 電極緩沖液（1250 ml 儲液 + 1250 ml 去離子水) 。
( 6 ) 蓋上電泳槽的安全蓋，并開始 SDS-PAGE。開始時以每塊膠 5 mA ( 設置最高 100V ) 跑大約 2 h。然后以每塊膠 15 mA ( 設置最高 200V ) 過夜跑大約 16 h，或更高的電流以便跑得更快（每塊膠 30 mA 大約 8 h)。
( 7 ) 當溴酚藍蹤跡遷移出凝膠下端后終止電泳。
( 8 ) 電泳結束后，小心地用塑料刮刀打開膠板。用刮刀將瓊脂糖從聚丙烯酰胺凝膠上去除。小心地從玻璃板上剝下凝膠，拎著它的下緣將其放入裝有固定液或染色液的盒子里。