橫向交變場的脈沖場凝膠電泳

DNA 分子質量標準 目的基因組 DNA

變性緩沖液 TAFE 凝膠電泳緩沖液 TE

優質瓊脂糖 循環水浴 TAFE 凝膠設備 水浴

一、材料

1. 緩沖液和溶液

變性緩沖液（0.5 N NaOH，1.5 mol/L NaCl）

含 0.5 μg/ml 溴化乙錠或適當稀釋度的 SYBR Gold 的 TAFE 凝膠電泳緩沖液

TAFE 凝膠電泳緩沖液（20 mmol/L Tris-乙酸（pH 8.2)，0.5 mmol/L EDTA）

TE ( pH 8.0)

2. 凝膠

優質瓊脂糖

3. 核酸和寡核苷酸

DNA 分子質量標準

目的基因組 DNA

4. 專用設備

循環水浴

TAFE 凝膠設備

設置 14℃ 的水浴

二、方法

TAFE 分離 DNA 片段

1. 在沒有溴化乙錠的 1X TAFE 緩沖液中灌制 1% 的瓊脂糖凝膠，待其凝結。制膠所用的緩沖液與充滿電泳槽的緩沖液相同。

2. 制備含有目的 DNA 的瓊脂糖栓并且進行限制酶消化。制備和包埋 DNA 標準品。

3. 10 倍體積 TE ( pH 8.0) 中漂洗所有的栓 30 min，其間換液兩次。

4. 經過消化和洗滌的 DNA 栓分別包埋至凝膠加樣孔中，利用 1X TAFE 緩沖液中的溶化的 1% 瓊脂糖封住加樣孔內的栓。

5. 將凝膠放入含有 1x TAFE 緩沖液的 TAFE 凝膠槽內，緩沖液事先 14℃ 冷卻。

6. 接通電源，設置 4s 脈沖，170~180 mA 恒流，電泳 30 min。這一處理使 DNA 迅速入凝膠。此后，降低電流輸入至 150 mA，脈沖時間設置為欲分離 DNA 的最適選擇，繼續電泳 12~18 h。

7. 斷開電源，取出凝膠，在含有 0.5 μg/ml 溴化乙錠或適當稀釋度的 SYBR Gold 的 1x TAFE 緩沖液染色。紫外燈下照相。



DNA 變性并轉移到尼龍膜

8. 用水洗染色的凝膠兩次。洗完兩次后倒去水，加入變性緩沖液輕微振搖溫育 30 min。 更換變性緩沖液后再溫育 30 min。

9. 在變性緩沖液中利用毛細管印跡直接將 DNA 轉移到尼龍膜上。

10. 轉移后，80℃，2 h 烘烤或紫外交聯或微波處理將 DNA 固定在尼龍膜上。

11. 在含有甲酰胺的緩沖液中用標記探針進行預雜交和雜交。