早期發現氨基糖苷類藥物是經直接作用于細菌30S核糖體亞單位、使細菌發生讀碼錯誤而最終導致細菌死亡的。近年來更加深入的研究表明，此類藥物是直接與30S核糖體亞單位的16S rRNA解碼區的A部位結合的。雖然氨基糖苷類藥物的結合點都是16S rRNA的保守區域，但它們對原核和真核核糖體的作用并不相同。
氨基糖苷類藥物屬靜止期殺菌藥，其殺菌作用具有如下特點：
1. 殺菌作用呈濃度依賴性；
2. 僅對需氧菌有效，尤其以對需氧革蘭陰性桿菌的抗菌作用為最強；
3. 具有明顯的抗生素后效應；
4. 具有首次接觸效應；
5. 在堿性環境中的抗菌活性增強。