氮藍四唑（NBT）法測定超氧化物歧化酶（SOD）活力

一、原理

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）普遍存在于動、植物體內，是一種清除超氧陰離子自由基的酶，它催化下列反應：

2O +2H →H O +O

本反應產物H O 可由過氧化氫酶進一步分解或被過氧化物酶利用。

本實驗依據超氧化物歧化酶抑制氮藍四唑（NBT）在光下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化物質存在下，核黃素可被光還原，被還原的核黃素在有氧條件下極易再氧化而產生超氧陰離子自由基，超氧陰離子自由基可將氮藍四唑還原為藍色的甲腙，后者在560nm處有最大吸收。而SOD可清除超氧陰離子自由基，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應后，反應液藍色愈深，說明酶活性愈低，反之酶活性愈高。據此可以計算出酶活性大小。

二、材料、 儀器 設備及試劑

（一）材料

水稻或小麥葉片。

（二） 儀器 設備

高速臺式離心機，分光光度計，微量進樣器，熒光燈（反應試管處照度為4000lx），試管或指形管數支。

（三） 試劑

（1）0.05mol/L磷酸緩沖液（pH7.8）。

（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：稱1.9399gMet用磷酸緩沖液定容至100ml。

（3）750μmol/L氮藍四唑溶液：稱取0.06133gNBT用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。

（4）100μmol/LEDTA-Na2溶液：稱取0.03721g EDTA-Na2，用磷酸緩沖液定容至1000ml。

（5）20 μmol/L核黃素溶液：稱取0.0753g核黃素用 蒸餾 水定容至1000ml，避光保存。

三、實驗步驟

1、酶液提取

取一定部位的植物葉片（視需要定，去葉脈）0.5g于預冷的 研缽 中，加1ml預冷的磷酸 緩沖液 在冰浴上研磨成漿，加 緩沖液 使終體積為5ml。取1.5－2ml于1000r/min下離心20min，上清液即為SOD粗提液。

2、顯色反應

取5ml指形管（要求透明度好）4支，2支為測定管，另2支為對照管，按下表加入各種溶液：

各溶液顯色反應用量

混勻后將1支對照管置暗處，其他各管于4000lx日光下反應20min（要求各管受光情況一致，溫度高，時間縮短，低時延長）。

3、SOD活性測定與計算

至反應結束后，以不照光的對照管作空白，分別測定其他各管的吸光度。

四、結果計算

已知SOD活性單位以抑制NBT光還原的50％為一個酶活性單位表示，按下式計算SOD活性。

SOD總活性＝

SOD比活力＝

式中：SOD總活性以鮮重酶單位每克表示；比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示；A 為照光對照管的吸光度；A 為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積ml，V 為測定時樣品用量ml；W為樣鮮重g；蛋白質含量單位為mg/g。