（二） 實驗操作流程
1. 細胞標記或動物標記等
進行生物發光實驗，首先根據實驗內容的不同，用熒光素酶基因標記腫瘤細胞、干細胞、病毒、藥物載體或動物，或者用Lux操縱子標記細菌。用熒光素酶基因標記可通過質粒、慢病毒或逆轉錄病毒等方法進行。
如果進行熒光實驗，就用GFP、EGFP或RFP標記腫瘤細胞、干細胞、病毒或動物等，后者用熒光染料（包括量子點）標記需要檢測的物質，如抗體，藥物載體等。
2. 體外預實驗檢測
需要檢測的細胞、病毒、細菌等標記后，在活體成像前，可以通過多孔板預先檢測一下標記是否成功，熒光素酶或熒光蛋白的表達強度等，并據此篩選陽性克隆、繪制標記物的發光梯度曲線等。體外預實驗是作為小動物活體成像解決方案中不可缺少的一部分。比如，利用體外預實驗初步檢測轉染熒光素酶的腫瘤細胞發光值，選擇轉染率相對高且穩定的一批細胞進行體內實驗。對于通常進行的細胞檢測來說，具體可以通過活體成像儀器檢測活細胞的發光強度，也可以通過體外化學發光和熒光檢測儀檢測細胞裂解液的發光強度。
當用體外化學發光和熒光檢測儀時，可以更準確地捕捉到發光值、更穩定的輸出發光值。對于生物發光方式而言，實驗所需的儀器是微孔板式化學發光檢測儀，如Berthold Centro LB 960。對于熒光方式而言，實驗所需的儀器是微孔板式熒光檢測儀，如Berthold TwinkleTM LB 970。(圖11-7)
圖11-7 左側為Berthold Centro LB 960，右側為Berthold TwinkleTM LB 970
3. 活體成像
首先麻醉實驗動物，可采用異氟烷（isoflurane）或克他命/甲苯噻嗪（ketamine/xylazine）混合液麻醉實驗動物。如果采用氣體麻醉，可先注射底物。氣體麻醉的優點是動物可以很快進入麻醉狀態，一旦停止麻醉氣體供應，動物會在幾分鐘內蘇醒。
對于生物發光實驗來說，接著注射底物熒光素。最佳的檢測時間是在注射后15到35分鐘之間。但需要注意的是，對于不同的動物模型，發光動力學過程并不完全一致，最好先進行預實驗確定何時發光信號最強。
成像，對于生物發光來說，檢測時間一般是1分鐘到5分鐘，如果信號特別弱，也可以延長到10分鐘，如果信號特別強，也可在1分鐘以內。對于熒光來說，檢測時間是1秒以內。為節約時間，檢測生物發光，最多可同時檢測5只小鼠。對于熒光實驗，麻醉好就可以馬上檢測。由于激發光照射的角度會影響檢測的信號值，所以熒光實驗建議每次只檢測1只動物。
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