流式細胞儀的使用

　　流式細胞儀（Flow cytometer）是對細胞進行自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學方面的特征參量并可以根據預選的參量范圍把指定的細胞亞群從中分選出來。多數流式細胞計是一種零分辨率的儀器，它只能測量一個細胞的諸如總核酸量，總蛋白量等指標，而不能鑒別和測出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是說，它的細節分辨率為零。

　　一．開機程序

　　1.檢查穩壓器電源，打開電源，穩定5分鐘。

　　2.打開儲液箱，倒掉廢液, 并在廢液桶中加入400ml漂白水原液。打開壓力閥，取出鞘液桶，將鞘液桶加至4/5滿(一般可用三蒸水，做分選必須用PBS或FACSFlow)，合上壓力閥。確實蓋緊桶蓋，檢查所有管路是否妥善安置。

　　3.將FACSCalibur開關打開，此時儀器功能控制鈕的顯示應是STANDBY，預熱5－10分鐘。排出過濾器內的氣泡。

　　4.如果需要打印，打開打印機電源。

　　5.打開電腦,等待屏幕顯示出標準的蘋果標志。

　　6.執行儀器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的氣泡。

　　7.分析樣品時，先用FACA Flow 或PBS進行HIGH RUN約2分鐘。

　　做過分選后，每次開機后需沖洗管道：向分選裝置上裝上兩個50ml離心管，不接通濃縮系統，摁下右下角白色按鈕開始沖洗。待自動停止

　　后接通濃縮裝置，同上法沖洗一次。

　　二.預設獲取模式文件(Acquisition Template Files)

　　1.從蘋果標志中選擇CELLQuest見一個新視窗，可利用此視窗編輯一個獲取模式文件。

　　2.選取屏幕左列繪圖工具中的Dot plot，繪出一個或多個Dot Plots(點圖)。從Dot Plot對話框中選取Acquisition作為圖形資料來源，并確定適當的x軸和y軸參數。

　　3.選取屏幕左列繪圖工具中的Histogram，同上法可繪出Histogram(直方圖)。

　　4.將此視窗命名后儲存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder \EXP文件夾中，下次進行相同實驗時可直接調用。

　　※本計算機中已設定兩個模式文件：ACQ和EXP，儲存于FACStation G3\BDApplications \CELLQuest \EXP文件夾中，ACQ用于細胞DNA檢測，EXP用于細胞表面標志分析。

　　三.用CELLQuest進行儀器的設定和調整

　　1.從蘋果畫面中選取CELLQuest，進入CELLQuest后在File指令欄中打開合適的獲取模式文件。

　　2.從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Connect to Cytometer(快捷鍵：＋B)進行電腦和儀器的連機。將出現的Acquisiton Control對話框移至合適位置。

　　3.從Cytometer指令欄中，開啟Detectors/Amps、Threshold、Compensation、Status等四個對話框，并將它們移至屏幕右方，以便獲取數據時隨時調整獲取條件。也可以用 +1，2，3，4獲得此四個對話框。

　　4.在Detectors/Amps對話框中，先為每個參數選擇適當的倍增模式(amplifier mode)：線性模式Lin或對數模式Log。一般進行細胞表面抗原分析如分析外周血的淋巴細胞亞群時，FSC和SSC多以線性模式Lin測量，且DDM Param選擇FL2，而FL1, FL2與FL3則以對數模式Log測量；分析細胞DNA含量時，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3皆以Lin進行測量，且DDM Param選擇FL2；分析血小板表型時，FSC，SSC，FL1，FL2，FL3等均以Log進行測量。

　　5.放上待檢測的樣品，將流式細胞儀設定于RUN，流速可在HIGH 或LOW上。

　　6.在Acquisiton 3 Control對話框中，選取Acquire，開始獲取細胞。在以下的儀器調整過程中隨時選取Pause，Restart以觀察調整效果。未完全調整好之前不要去掉SETUP前的“

　　7.在Detectors/Amps對話框中，調整FSC和SSC探測器中的信號倍增度：PMT voltages(粗調)與Amp Gains(細調)，使樣品信號出現在FSC-SSC點圖內,且三群細胞合理分布。

　　8.在Threshold 對話框中選擇適當的參數設定Threshold，并調整Threshold的高低，以減少噪音信號(細胞碎片)。一般做細胞表型時用FSC－H而做DNA時用FL2－H。Threshold并不影響檢測器對信號的獲取，但可改善畫面質量。

　　9.從屏幕左列繪圖工具中選取Region(區域)，并在靶細胞周圍設定區域線，即通常所說的門。圈定合適的細胞群可使儀器調整更為容易。

　　10.Detectors/Amps對話框中，調整熒光檢測器(FL1, FL2, FL3, FL4等)的倍增程度。根據所用的熒光陰性對照樣品調整細胞群，使之分布在正確的區域內。

　　11.在Compensation對話框中，根據所用的調補償用標準熒光樣品調整雙色(或多色)熒光染色所需的熒光補償。比如，應該為FL1+FL2-的細胞群卻分布在FL1＋ FL2＋區域內，則需調大FL2－，？％FL1中的“？”并從FL1-FL2點圖中觀察新的調整是否恰當

　　12.在Status對話框中可見：Laser Power:正常值—Run/Ready為14.7mW，Standby為5mW；Laser current:正常值為6Amps左右。

　　13.調整好的儀器設定可在Instrument Settings對話框中儲存，下次進行相同實驗時可調出使用，屆時只需微調即可。

　　※本計算機中已有三個名叫儲存于FAC Station G3/BDApplications/CELL Quest Folder/IMM-InstrSettings及FAC Station G3/BD Files/Instrument Settings Files/CalibFile和Mast-Cell-Set的參數文件，前二者可用于分析人白細胞，后者用于分析小鼠肥大細胞。

　　四.通過預設的獲取模式文件進行樣品分析：

　　1.從蘋果標志中選擇CELLQUEST，新視窗出現后從File指令欄中選擇Open，打開預設的獲取模式文件。

　　2.從屏幕上方Acquire指令欄中，選取Connect to Cytometer進行電腦和儀器的連機。將出現的Acquisiton Control對話框移至合適位置。

　　3.從Cytometer指令欄中選取Instrument Settings，在其對話框中選擇Open以調出以前存儲的相同實驗的儀器設定，按Set確定。

　　4.在Acquire指令欄中，選擇Acquisition&Storage決定儲存的細胞數，參數，信號道數。其中Resolution在做細胞表面標志時選擇256，做DNA時選擇1024。Parameter Saved…則根據不同的檢測對象選擇不同的參數。

　　5.在Acquire指令欄中，選擇Parameter Description，以決定文件存儲位置(folder)，文件名稱(file)，樣品代號以及各種參數的標記(panel)，即安排tube1，2，3…的檢測參數。一般本儀器獲取的數據按照檢測對象的不同分別儲存于FACStation G3/BD Applications/CELLQuest/IMM 和DNA 文件夾中。文件根據日期命名。

　　6.在Cytometer指令欄中，選擇Counters，將此對話框移至合適位置，以便于隨時觀察events計數。

　　7.將樣品試管放至檢測區，在Acquire Control對話框中選取Acquire以啟動樣品分析測定。

　　8.微調儀器設定，待細胞群分布合適后選擇Acquire Control對話框中Pause，Abort，開始正式獲取信號，存儲數據。

　　9.當一定數目的細胞被測定后，獲取會自動停止，并會自動存儲數據。重復步驟7，繼續分析下一個樣品，直到所有的樣品數據分析完畢。當所有樣品分析分析完畢，即，換上三蒸水，并將流式細胞儀置于“STANDBY”狀態，以保護激光管。

　　五.關機程序：

　　1.從File中選擇Quit，退出軟件，選擇Don’t Save至蘋果屏幕。

　　2.用4mL，1：10稀釋的漂白水作樣品，將樣品置于旁位(vacuum is on)，以外管吸去約2mL，在將樣品架置于中位(vacuum is off)，再HIGH RUN 5分鐘(內管吸去2mL)。

　　3.改用三蒸水4mL作樣品，同上處理。

　　4.按Prime三次。

　　5.此時儀器自動轉為STAND-BY狀態，換2mL三蒸水。必須在儀器處于“STANDBY”狀態 ，10分鐘后再依次關掉計算機、打印機、主機、穩壓電源，以延長激光管壽命，并確保應用軟件的正常運行。

　　6.填寫使用登記表。