流式細胞儀檢測細胞凋亡的原理

一、原理

在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin V進行熒光素（EGFP、FITC）標記，以標記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。

二、注意事項
1、必須活細胞檢測，不能用能破壞細胞膜完整性的固定劑和穿透劑固定或穿膜。
2、特殊細胞的染色方法：在消化或吹打時，有些細胞（如神經元細胞）很容易受到損傷，導致晚期凋亡或壞死比例非常高，不能反映真實結果。實驗的解決方法：先低速離心，吸取細胞培養板中的液體，留少許液體，加入適量PI和Annexin-V染色10min后，將漂浮細胞吸至離心管中，離心洗滌兩次，用PBS漂洗貼壁細胞兩次，加胰酶消化后將細胞懸液移至另一離心管中，離心洗滌，再與漂浮細胞合并后上流式細胞儀檢測。應用該法可降低晚期凋亡和壞死比例，增加早期凋亡細胞比例。
3、由于Annexin-V為鈣離子依賴的磷脂結合蛋白，只有在鈣離子存在的情況下與PS的親和力才大，因而在消化細胞時，建議一般不采用含EDTA的消化液。
4、必須設置陰性對照和補償對照（分別單染）。