圖 11. 將利妥昔抗體還原、烷基化、胰蛋白酶切后，酶切后肽段的基峰色譜圖。
圖 12. 利妥昔單抗輕鏈和重鏈的氨基酸序列。黑色字母顯示的氨基酸代表通過二級質譜圖鑒定到的部分。綠色顯示的序列是僅通過完整肽段一級全掃描數據鑒定到的。紅色顯示的是重鏈部分的兩個氨基酸（AK），他們既不能用一級也不能用二級質譜鑒定到。對于輕鏈來說，最終的序列覆蓋率是 100%（二級質譜鑒定覆蓋率是 96%），對于重鏈來說是 99.5%（二級質譜鑒定的覆蓋率是 98.8%）。重鏈中天冬酰胺301 表示糖基化位點。
對于重鏈，也可以根據完整肽段的準確質量數鑒定肽段GQPR。最后，根據二級譜圖，含糖基化位點 Asn301 的肽段沒有鑒定到其未糖基化的形式。而對其進行基于理論糖基化修飾的數據庫檢索則很成功。此外，很容易在全掃描譜圖中檢測到糖肽，可以看到不同的糖基化形式和不同的電荷態。由于存在特征峰，二級譜圖上也很容易看到。
圖 13. 糖肽氨基酸序列 297-305 (EEQYN*STYR, *=G0F) 的二級質譜圖，其母離子是三價電荷。
插圖顯示的是在全掃描質譜圖中二價和三價母離子的同位素分布。
圖 13 顯示的是一個含 G0F 肽的譜圖舉例，顯示了完整母離子和用 HCD 裂解糖肽得到的典型裂解類型：質量數為204 的 hexonium 離子（HexNAc）和質量數為 366 的離子（Hex-HexNAc）以及階梯式碎片離子：己糖（m/z 162）、N-乙酰基氨糖（203）和巖藻糖（146）。綜合考慮基于所有肽段的一級全掃描和基于數據庫搜索的二級質譜圖，重鏈的序列覆蓋率達 99.5%，只有兩個氨基酸（ 氨基酸 343-344）沒有檢測到。
結論
在本研究中，我們提供一種新流程，結合快速色譜，利用兩種規格的整體柱和高分辨 Orbitrap 質譜儀，對完整及還原利妥昔進行了分析，采用 AIF，Multiplexed HCD 自上而下的裂解，以及自下而上的分析方法進行序列驗證。即使抗體的上樣量低至 500 pg，我們仍可以得到高質量的質譜圖，該數據證明了 LC-MS 儀器的高靈敏度。此外，為了分析還原型單克隆抗體，我們采用色譜的方法將抗體的重鏈和輕鏈分開，設置不同的分辨率對其進行檢測。通過這個流程，我們可以測定完整抗體的分子量，對輕鏈和重鏈的氨基酸序列進行確認和驗證，對該抗體不同糖基化形式的相對豐度進行鑒定和評價。
致謝
感謝 Daniel Purstinger 在樣品制備過程中給予的幫助，感謝Remco Swart 提供本研究當中用到的 PepSwift 和 ProSwift 整體柱。感謝奧地利聯邦經濟、家庭、青年部和全國研發技術部提供的財政支持
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