Southern印跡雜交是先將DNA樣品（含不同大小的DNA片段）先按片段長短進行分離，然后進行雜交。這樣可確定雜交靶分子的大小。因此，制備DNA樣品后需要進行電泳分離。在恒定電壓下，將DNA樣品放在0.8～1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，標準的瓊脂糖凝膠電泳可分辨70－80000bp的DNA片段，故可對DNA片段進行分離。但需要用不同的膠濃度來分辨這個范圍內的不同的DNA片段。原則是分辨大片段的DNA需要用濃度較低的膠，分辨小片段的DNA則需要濃度較高的膠。經過一段時間電泳后，DNA按分子量大小在凝膠中形成許多條帶，大小相同的分子處于同一條帶位置。另外為了便于測定待測DNA分子量的大小或是所處的分子大小范圍，往往同時在樣品鄰近的泳道中加入已知分子量的DNA樣品即標準分子量DNA （DNA marker）進行電泳。DNA marker可以用放射性核素進行末端標記，通過這種方式，雜交后的標準分子量DNA也能顯影出條帶。