用交換反應進行5突出端DNA分子的磷酸化

T4 噬菌體多核苷酸激酶 DNA

ADP 乙酸銨 ATP EDTA 乙醇 咪唑緩沖液 聚乙二醇

液體閃爍計數儀 Sephadex G-50 離心柱 Sephadex G-50 柱

一、材料

1. 緩沖液和溶液

ADP (1 mmol/L)

乙酸銨（10 mol/L）

ATP (10 mmol/L)

EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)

乙醇

10X 咪唑緩沖液（500 mmol/L 咪唑鹽酸（pH 6.4），180 mmol/L MgCl2，50 mmol/L DTT，1 mmol/L 亞精胺鹽酸，1 mmol/L EDTA (pH 8.0)）

聚乙二醇（24% m/V PEG 8000，水配制）

2. 酶和緩沖液

T4 噬菌體多核苷酸激酶

3. 核酸和寡核苷酸

DNA (10~50 pmol m 5'-磷酸化的末端）

4. 放射性化合物

[γ-³²P] ATP ( 10 mCi/ml，比活性為 3000~7000 Ci/mmol）

5. 專用設備

液體閃爍計數儀，能通過切侖科夫輻射定量 ³²P

Sephadex G-50 離心柱，用 TE（pH 7.6) 平衡

或

Sephadex G-50 柱（1 ml)，用 TE ( pH 7.6) 平衡

二、方法

1. 在一個微量離心管中按下列順序混合：

含 5' 末端磷酸的 DNA                      10~50 pmol

10X 咪唑緩沖液                                5 μl

1 mmol/L ADP                                 5 μl
 
50 nmol/L ATP                                 1 μl

10 mCi/ml [γ-³²P] ATP

（比活性為 3000~7000 Ci/mmol)       20~100 pmol

水                                                   加至 40 μl

24% (m/V) PEG                              10 μl

T4 噬菌體多核苷酸激酶（20 單位）  1 μl

輕彈管外壁以混合各成分，37℃ 溫育反應 30 min。

2. 加入 2 μl 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0) 以終止反應。用液體閃爍計數儀的切侖科夫計數檢測反應混合物中的總放射性活度。

3. 通過下列任一方法分離放射性標記探針與未摻入dNTP：

用 Sephadex G-50 離心柱層析

或

用 1 ml Sephadex G-50 柱（用 TE 平衡）常規尺寸排阻層析

或

進行兩輪乙酸銨和乙醇選擇性沉淀放射性標記的 DNA

4. 通過契侖科夫計數測定探針制品中的放射性量，用探針中放射性含量除以反應混合物中的放射性總量來計算放射性標記物轉移到 5' 端的效率。