用有機溶劑抽提法從DNA中除去溴化乙錠實驗

DNA 樣品

乙醇 水飽和的異戊醇或 n-丁醇 酚 TE

透析管和夾 離心機和轉頭

一、材料

1. 緩沖液和溶液

乙醇，水飽和的異戊醇或 n-丁醇（從離心制備的 DNA 中去除溴化乙錠要上述兩種有機溶劑之一。），酚，酚：氯仿（1:1, V/V)，TE ( pH 8.0)。

2. 核酸和寡核苷酸

通過 CsCl 梯度離心純化的 DNA 樣品

3. 離心機和轉頭

帶有 HL-4 的轉頭和 50 ml 離心管的 Sorvall RT-6000 離心機（或與其相當的設備）

Sorvall SS-34 轉頭（或與其相當的轉頭）

4. 專用設備

透析管和夾或用于旋轉透析的微量濃縮器（Amicon) 。

二、方法

1. 提取 DNA 溶液、去除溴化乙錠

(1) 將 DNA 溶液加到玻璃管或塑料管中，加入等體積的水飽和的 n-丁醇或異戊醇，蓋緊管蓋。

(2) 振蕩混合有機相和水相。

(3) 在室溫下離心該混合物 3 min，450 g ( 用 HL-4 轉頭和 50 ml 的離心管在 Sorvall RT-6000 離心機上為 1500 r/min ) 或放置于室溫直到有機相和水相分離。

(4) 用巴斯德吸管將上層有機相（呈漂亮的深粉紅色）轉移至適當的廢物容器中。

(5) 重復抽提（按第 1~4步）4~6 次直到水相和有機相均不見粉紅色。

2. 從 DNA 溶液中去除 CsCI

(1) 用乙醇沉淀法（按第 7~12步）從 DNA 溶液中去除 CsCl，或用微量濃縮器（Ami-con ) 進行旋轉透析或用 2L TE ( pH 8.0 ) 過夜透析 16 h ( 不斷換緩沖液 )。如果是用后兩種方法之一，則可直接進行步驟 8。

(2) 欲從 CsCl-DNA 溶液中沉淀 DNA，則加入 3 倍于 CsCI 溶液體積的水，充分混勻。

附加的該步處理使 CsCl 得到稀釋并防止其被乙酵沉淀。

(3) 向 DNA 溶液中加入 8 倍體積的乙醇（在第 2 步用水稀釋前的 CsCl-DNA 溶液的體積為 1 體積）并充分混合，于 4℃ 存放至少15 min。

若讓沉淀反應于 4℃ 過夜，則能得到較高的 DNA 回收率。

重要：若 DNA 的乙醇溶液存貯于 -20℃，則 CsCl 會沉淀。

(4) 在 4℃ 下用 20000 g 離心（Sorvall SS-34 轉頭 13000 r/min）15 min 收集 DNA 沉淀。

(5) 將上清液移注到潔凈的離心管中，并加入等體積的乙醇溶液。于 4℃ 放置此混合物至少 15 min，然后于 20000 g 離心 15 min ( Sorvall SS-34轉頭 )，收集 DNA 沉淀。

(6) 用 70% 的乙醇洗滌上述兩次所得的 DNA 沉淀，然后盡可能去除所加的 70% 的乙醇，并讓殘留液體于室溫下揮發。

(7) 用 2 ml H₂O 或 TE ( pH 8.0 ) 溶解 DNA 沉淀。

若用于 DNA 測序，DNA 應溶于 H₂O 中；若 DNA 需長期保存，TE ( pH 8.0 ) 是更好的選擇。

(8) 若此重溶后的 DNA 從其顏色或當在紫外線照射時發出的熒光判斷還明顯含有溴化乙錠，則再次用酚或酚：氯仿抽提一次，然后再用乙醇沉淀 DNA。

(9) 測定 DNA 終溶液的 OD₂₆₀ 值，計算 DNA 的濃度。分裝成小份貯存于 -20℃。