痘苗病毒儲液制備——噬斑分析測定滴度

經胰酶作用的系列稀釋病毒儲液常被用于感染適當的細胞系。經過幾天的培養后，吸出培養基，將細胞用結晶紫染色。由于感染細胞變縮、變圓和脫落，形成直徑 1～2 mm 顏色較淡的噬斑。

生長良好的貼壁培養的單層 BSC-1 細胞病毒儲液

0.1% 結晶紫（溶于 20% 乙醇）

6 孔 35 mm2 組織培養板

1. 胰酶消化匯片生長的單層 BSC-1 細胞（見「細胞培養實驗」基本方案 1 步驟 4～7）。

2. 用血細胞計數器對細胞進行計數。

3. 將 5 × 10⁵ 個/孔 BSC-1 細胞加入 2 ml 完全 MEM-10 培養基在 6 孔的 35 mm² 組織培養板中培養，放入 5% CO₂ 加濕培養箱中 37°C 培養過夜，直到細胞生長至匯片。

4. 胰酶處理病毒儲液（見基本方案 步驟 4）。

5. 用完全 MEM-2.5 培養基對胰酶處理后的病毒儲液進行 9 次 10 倍系列稀釋，注意每次稀釋必須用新的吸管。

6. 吸出 BSC-1 細胞的培養基，用 0.5 ml 10^-7、10^-8、10^-9 病毒稀釋液感染細胞，每個稀釋度感染兩個孔。放入 CO₂ 培養箱中 37° C培養 1～2 h，每隔 15～30 min 輕輕搖動培養板，使病毒均勻分布，細胞保持潮濕。

7. 在每個孔中加入 2 ml 的完全 MEM-2.5 培養基，放入 CO₂ 培養箱中 37°C 培養 2 天。

8. 吸出培養基，每孔加入 0.5 ml 的 0.1% 結晶紫，室溫下孵育 5 min。

9. 吸出結晶紫，使孔晾干。

10. 計算每孔中的噬斑數確定滴度，再乘以稀釋倍數。

每孔中有 20～80 個噬斑一般可以取得較好的結果，在測定滴度時，可以考慮用胰酶對病毒儲液進行 1:1 稀釋。