堿基編輯研究獲進展，為工業菌株改造提供新思路

發布時間：2021-06-02 15:18 原文鏈接：堿基編輯研究獲進展，為工業菌株改造提供新思路

　　鏈霉菌是許多重要天然產物的生產者，其基因組蘊含著大量未被開發的次級代謝生物合成基因簇。傳統的基于雙鏈斷裂的CRISPR/Cas9技術雖然已應用于鏈霉菌的基因組編輯，但需提供外源修復模板，且在多位點同時編輯的應用上仍有局限性。近年來，單堿基編輯技術已應用于天藍色鏈霉菌等一些模式菌株中，相較于傳統CRISPR技術更為方便快捷。堿基編輯的效率與底盤菌株尿嘧啶DNA糖苷酶（UDG）的功能密切相關，前期研究多用枯草芽孢桿菌噬菌體來源的尿嘧啶DNA糖苷酶抑制因子UGI來提升堿基編輯效率，但在某些情況下，其抑制效果并不理想。

　　中國科學院天津工業生物技術研究所研究員王猛帶領的高通量編輯與篩選平臺實驗室，與天津科技大學教授花而并團隊合作，在模式菌株變鉛青鏈霉菌Streptomyces lividans 66中研究了UDG與堿基編輯效率的關系，開發出新一代堿基編輯器asRNA-BE（antisense RNA interference-enhanced CRISPR/Cas9 Base Editing method）。科研人員利用融合了胞苷脫氨酶rAPOBEC1的BE系列堿基編輯器，實現基因組三個次級代謝基因的編輯。在此基礎上，利用CRISPR/Cas9輔助的基因敲除手段，分別構建了尿嘧啶DNA糖苷酶UDG1和UDG2的單敲和雙敲菌株，發現在失活UDG1的情況下，堿基編輯效率可較原始提高3.4倍到67.4倍不等。考慮到UDG是細胞修復過程中的關鍵酶，其長期缺失不利于菌株基因組的穩定，科研人員利用反義RNA干擾降低基因表達水平的策略代替基因敲除，在原始的BE編輯器基礎上整合了針對UDG的反義RNA干擾模塊，構建了新一代堿基編輯器asRNA-BE，將編輯效率提高至原來的2.8倍到65.8倍不等。asRNA-BE編輯器可以在堿基編輯過程中瞬時抑制UDG的表達，而在編輯結束后又可以通過溫敏型質粒的消除恢復UDG的表達水平，在提高編輯效率的同時避免了對于細胞不可逆的傷害。基因組測序結果也表明，與BE編輯器相比，asRNA-BE編輯器在大幅度提高編輯效率的同時，并未引起額外的脫靶，在工業菌株改造等方面具有良好的應用前景。

　　相關研究成果以封面文章的形式發表在ACS Synthetic Biology上。天津工生所助理研究員張玥為論文第一作者。研究工作得到國家重點研發計劃、天津市合成生物技術創新能力提升行動、國家自然科學基金等的支持。