磷酸鈣介導的真核細胞轉染實驗

真核細胞

CaCl2 HEPES緩沖液 氯化銫 PBS

培養箱 錐形管 離心管

1.  在轉染前一天將細胞分入10 cm 組織培養平板中。當被轉染的細胞是貼壁細胞，倍增時間為18~24 h時，一般按1：15從長滿的培養皿中分細胞效果較好，轉染的當天，細胞應在培養皿中很好地分散分布。在加入沉淀前2~4 h，用9 ml 完全培養液培養細胞。

2.  將要轉染的DNA用乙醇沉淀，空氣中晾干沉淀。將DNA沉淀重懸于450 μl 無菌水中，加50 μl 2.5 mol/l CaCl₂。

3.  加500 μl 2×HeBS于一無菌的15 ml 錐形管中，將機械式移液器安上1 ml 吸頭， 一邊吹打2XHeBS，一邊用巴斯德吸管逐滴加入DNA/CaCl₂溶液，隨即在漩渦混合器上振蕩5 s，將其在室溫下靜置20 min 以形成沉淀。

4.  將沉淀均勻加入10 cm 平板的細胞中，輕輕晃動。

5.  在標準生長條件下培養細胞4~16 h，除去培養液，用5 ml 1×PBS洗細胞2次，加 10 ml 完全培養液培養細胞。

6.  對于短暫分析實驗，可在既定的時刻收集細胞。對于穩定轉化，讓細胞生長兩個倍增時間后分入培養皿中進行選擇培養。

磷酸鈣沉淀的形成