禽流感病毒RNA的三種提取方法

實驗概要

本實驗介紹了禽流感病毒RNA的三種提取方法：異硫氰酸胍提取，TRIzol LS提取及Trizol法。

實驗步驟

1. 用異硫氰酸胍提取

   1) 取200ul樣品數 陰性對照 陽性對照個1.5ml滅菌eppendorf管。
   2) 加600ul異硫氰酸胍，然后加入對照和樣品，再加200ul氯仿，顛倒混勻。
   3) 13000rpm離心15min。
   4) 在第3步離心快結束時，另取同樣多eppendorf管，加入400ul -20度預冷的異丙醇。
   5) 取第3步離心的上清（一定不要吸取到中間白色層，第3步離心結束往外拿的時候，管子盡量不要傾斜）轉移到第4步準備的管中，顛倒混勻。
   6) 13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體。
   7) 加600ul 75％乙醇，顛倒數次以洗滌殘存異丙醇。
   8) 13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體。
   9) 4000rpm離心10sec，將管壁殘存液體甩到底部，用微量槍頭吸干，室溫干燥2－3min（不可過分干燥，防止下一步RNA不溶解）。
   10) 加入20ul DEPE水(加入depc的純水高壓后的水即為DEPE水)，輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5sec，冰上保存備用（最好2小時內使用，以免RNA降解）。

2. 用TRIzol LS提取

應用TRIzol LS提取病毒RNA

所提取物為血清、血液、細胞培養液、雞胚尿囊液等液體中的病毒。提取時盡量在人少時進行，防止空氣中RNA酶的污染。所用一切物品也應是無RNA酶的。
   1) 在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzol LS 500ul，充分混勻，室溫放置10min。
   2) 加入200ul的氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管（溶液充分乳化，成乳白狀，無分相現象），室溫放置10min （由于氯仿沸點低、易揮發，振蕩時離心管可能爆開，小心）。
   3) 離心 4℃、13000r/min、15min，取上層液相移入另一管（切忌吸動白色中間相）。 |
   4) 加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10min。
   5) 離心 4℃、13000r/min、15min，（這時乍一看會發現管子里好像沒有東西，再仔細看看，會發現靠近管底的壁上有一星點的白色沉淀物，就是它了）用槍小心吸去所有上清。
   6) 1ml75%乙醇洗一遍，離心 4℃、8000r/min、10min，（這時又會發現管子沒東西了，不要擔心，有的，但是因為量太少看不見罷了）用槍小心吸去所有上清，在超凈臺中干燥5min。
   7) 加入適量DEPC處理水。（如果材料來源豐富的話，加入的水量為下一步RT的total減去其他試劑的量；若要省著點用，則自己看著辦了，盡量不要加太多的水）。
   8) 建議立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇后凍存于－70℃，可保存一年；若加入DEPC水后則只能在－20℃保存1個月左右。

3. Trizol法提禽流感病毒
   1) 取雞胚尿囊液，加入5-10倍體積 Trizol液，混勻；
   2) 室溫放置5分鐘，然后以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒；
   3) 取上層水相于一新的離心管，按每ml Trizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘；
   4) 棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混勻，4℃下7500g離心5分鐘；
   5) 重復第4步；
   6) 小心棄去上清液，然后室溫干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度；
   7) 然后將RNA溶于水中，放置10分鐘。

注意事項

1. 整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。
2. 加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。