染色(免疫熒光)
10. 晾干切片,使用免疫組化筆標出類器官切片的部分。
11. 使用適合的封閉緩沖液在室溫封閉1小時(或按照常用的封閉方法進行封閉)。
12. 加一抗,室溫孵育2小時,或在4度孵育過夜。
13. 用PBS清洗2次,每次2分鐘。
14. 加二抗,室溫孵育1小時。避光。
15. 用PBS清洗兩遍,用dH2O清洗一遍。每次2分鐘,晾干。
16. 在每個切片上加一滴含DAPI的ProLong? Gold防猝滅封固劑,輕輕覆蓋一片蓋玻片。用一個200 μL槍頭輕壓蓋玻片,壓出氣泡。靜置10-15分鐘。
17. 使用透明的指甲油封上載玻片,晾干15分鐘。
18. 使用熒光顯微鏡觀察。
染色(H&E)
19. 把類器官部分放在haematoxylin里5分鐘,然后使用自來水清洗1分鐘 。
20. 對類器官切片進行染色(如蘇木精染色),可以用碳酸鋰或“Scott’s tap water” 染色1分鐘,然后用自來水清洗一分鐘。
21. 將切片放在1% acid alcohol里30秒,用自來水清洗1分鐘。
22. 把切片放入eosin(伊紅)內染色5分鐘,用自來水請洗1分鐘。
23. 脫水:使用95% 乙醇脫水10分鐘×2。使用100% 乙醇脫水3分鐘×2。使用二甲苯脫水5分鐘×3。
24. 使用封固劑將切片固定,用指甲油密封。
染色(阿爾新藍)
a) 3% 醋酸溶液:冰醋酸 3 mL,dH2O 97 mL
b) 阿爾新藍溶液(Alcian Blue solution) pH 2.5:dH2O 97 mL,3% 醋酸溶液 3 mL,阿爾新藍 (Alcian Blue)1 g,使用蒸餾水溶解染料,加酸攪勻。用醋酸溶液來調整pH,過濾*。避光保存。
*使用阿爾新藍溶液(Alcian Blue) 前一定要過濾
c) 0.1% 核固紅
25. 將切片放入3% 醋酸溶液3分鐘(用來當媒染劑)。
26. 使用過濾后的阿爾新藍溶液(Alcian Blue) pH 2.5室溫染色30分鐘。
27. 使用自來水清洗2分鐘。
28. 用蒸餾水沖洗。
29. 使用0.1% 核固紅復染2到5分鐘。
30. 用自來水沖洗2分鐘。
31. 使用二甲苯脫水,清洗
70% 乙醇 - 2分鐘
95% 乙醇 - 2分鐘×2
100% 乙醇 - 2分鐘×2
二甲苯 - 3分鐘×2
32. 使用合成永久性封固劑固定切片。這個步驟需在通風柜內完成。固定前,把切片置于二甲苯中。保持濕潤。切片上有二甲苯有利于封固劑的固定。
注意:使用不同pH的阿爾新藍( Alcian Blue)可檢測更酸性或更硫酸化粘蛋白(sulfated mucins)。但若要檢測這些蛋白,需使用不同的酸進行溶解。
阿爾新藍(Alcian Blue)pH 1.0:使用90 mL的蒸餾水里和10 mL的1N鹽酸(hydrochloric acid)溶解1g的阿爾新藍(Alcian Blue)。
配制1N鹽酸:蒸餾水 915 mL,濃鹽酸(concentrated hydrochloric acid) 85 mL
阿爾新藍 (Alcian Blue) pH 0.2:使用100 mL的10% 硫酸(sulphuric acid)溶解把1 g的阿爾新藍(Alcian Blue)
配制10% 硫酸溶液:蒸餾水 90 mL,濃硫酸 10 mL
當使用強酸染料溶液時,將復染核固紅之前的清洗改為排酸并用紙吸干。