細胞的凍存實驗主要用于：（1）長時間保存細胞系；（2）防止細胞保存液內產生冰晶。
| 實驗方法原理 | 已長滿的細胞經胰蛋白酶處理后，重懸于凍存液中。兩種試劑即甘油和 DMSO 是常用的細胞保護劑，它們在細胞保存液中起到防止細胞內冰晶形成的目的。血清的濃度經常增加至 20%。 |
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| 實驗材料 | 細胞 |
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| 試劑、試劑盒 | 胰蛋白酶凍存液 |
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| 儀器、耗材 | 細胞凍存器 |
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| 實驗步驟 | 1) 吸干已長滿細胞的細胞瓶內培養液。
細胞不應在高密度狀態下凍存，并應在凍存的 24 小時內換液。
2) 加 2 ml 胰蛋白酶（T-25 細胞培養瓶）處理細胞。
3) 讓液體在細胞表面來回流動 4~5 次。
4) 吸干胰蛋白酶液。
5) 重復步驟 3 和 4。
6) 置 37°C 3~5 分鐘。
7) 將細胞從細胞培養瓶表面洗下，重懸細胞于 3~5 ml 培養液中。
8) 離心，200 g，5 分鐘；重懸沉淀于 1 ml 凍存液中。
凍存液
細胞生長培養液（RPMI,DMEM 等） 7 ml
FBS 2 ml
甘油或 DMSO 1ml
小心：甘油；DMSO
甘油或 DMSO 的濃度介于 5%~20% 之間。生長培養液的體積應調整以適于所用細胞保護劑的變化。
如果欲凍存懸浮細胞，沉淀 5x106~10x106 對數生長期細胞，重懸沉淀于 1 ml 凍存液中。
9) 加入 1 ml 細胞（單層細胞約為 3x106~5x106; 懸浮細胞約為 5x106~10x106) 于
凍存管上標明細胞系的名稱、日期和生長培養液。
10) 置凍存管于 Nalgene 細胞凍存器中，并讓細胞凍存管在-80°C 過夜或利用可控速率的冷凍裝置。
11) 次口，將凍存管轉移至液氮中。此步驟操作宜迅速，凍存液不應融化。 展開 |
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| 注意事項 | 將凍存管轉移至液氮中。此步驟操作宜迅速，凍存液不應融化。 |
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| 其他 | 將細胞放在低溫環境，減少細胞代謝，以便長期儲存。
來源《細胞實驗指南（上冊)》作者：黃培堂。 |
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