采集標本 標本的選擇根據感染部位。可取痰、支氣管灌洗液、尿、糞、腦脊液或胸、腹水。其他肺外感染可取血或相應部位分泌液或組織細胞。
直接涂片鏡檢 標本直接涂片或集菌后涂片，用抗酸染色。若找到抗酸陽性菌即可初步診斷。抗酸染色一般用Ziehl-Neelsen法。為加強染色，可用IK(intensified Kinyoun)法染色。將石炭酸復紅染色過夜，用0.5% 鹽酸乙醇脫色30s，則包括大多結核分枝桿菌L型也可著色。為提高鏡檢敏感性，也可用金胺染色，在熒光下結核分枝桿菌呈顯金黃色熒光。
濃縮集菌 先集菌后檢查，可提高檢出率。培養與動物試驗也必須經集菌過程以除去雜菌。腦脊液和胸、腹水無雜菌，可直接離心沉淀集菌。痰、支氣管灌洗液、尿、糞等污染標本需經4% NaOH（痰和堿的比例為1:4,尿、支氣管灌洗液和堿的比例為1:1）處理15min，時間過長易使結核分枝桿菌L型與非結核分枝桿菌死亡。尿標本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml于錐形量筒內靜置，取沉淀物處理。處理后的材料再離心沉淀。取沉淀物作涂片染色鏡檢。若需進一步作培養或動物接種，應先用酸中和后再離心沉淀。
分離培養 將經中和集菌材料接種于固體培養基，器皿口加橡皮塞于37℃培養，每周觀察1次。結核分枝桿菌生長緩慢，一般需2～4周長成肉眼可見的落菌。液體培養可將集菌材料滴加于含血清的培養液，則可于1～2周在管底見有顆粒生長。取沉淀物作涂片，能快速獲得結果，并可進一步作、藥敏等測定和區分結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌。國內學者已證明結核分枝桿菌L型可存在于血細胞內或粘附于細胞表面。這種患者往往血沉加快，用低滲鹽水溶血后立即接種高滲結核分枝桿菌L型培養基能提高培養陽性率。
動物試驗 將集菌后的材料注射于豚鼠腹股溝皮下，3～4周后若局部淋巴結腫大，結核菌素試驗陽轉，即可進行解剖。觀察肺、肝、淋巴結等器官有無結核病變，并作形態、培養等檢查。若6～8周仍不見發病，也應進行解剖檢查。
快速診斷 一般涂片檢查菌數需5x103～4/ml,培養需1x102/ml,標本中菌數少于此數時不易獲得陽性結果，且培養需時較長。目前已將多聚酶鏈反應（PCR）擴增技術應用于結核分枝桿菌DNA鑒定，每ml中只需含幾個即可獲得陽性，且1?2d得出結果。操作中需注意實驗器材的污染問題，以免出現假陽性。又細菌L型由于缺壁并有代償性細胞膜增厚，而一般常用的溶菌酶不能使細胞膜破裂釋出DNA，以致造成PCR假陰性。用組織磨碎器充分研磨使細胞破裂后，則可出現陽性。目前有條件的單位使用BACTEC法，以含14C棕櫚酸作碳源底物的7H12培養基，測量在細菌代謝過程中所產生的14C量推算出標本中是否有抗酸桿菌，5～7d就可出報告。
近年來國內外研究證明臨床各種類型的肺結核患者中40% 左右分離出L型。經治療的結核病人細菌型消失，L型常持續存在。有空洞患者痰中已不排細菌型者，8% 左右仍可檢出L型。故有學者建議將多次檢出L型亦作為結核病活動判斷標準之一，細菌型與L型 均轉陰才能作為痰陰性。