動物胚或幼體的大腿肌組織為最好的培養材料。取材常用生后1~2 天的乳鼠（Wistar 大鼠更好）。
1. 殺死動物，無菌取大腿肌組織，切成0.3~0.5 厘米小塊；
2. 用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25 %胰蛋白酶消化，無菌紗網或紗布濾過，合成培養基加10 %小牛（或馬）血清培養，為促進分分蘗節經可加1 %的胎汁；
3. 細胞接各量為2×106 /皿；接種在膠原或明膠的底物上能促進細胞分化。明膠制備比較簡單，常用Hanks液配的0.01 %明膠。
細胞接種率約為50 %；細胞生長開始呈紡錘形，培養50~52 小時后將出現融合形成肌細胞狀多核纖維。數日后融合停止，此時能觀察到橫紋。一般在融合后二三天內能見到收縮現象；因收縮運動有時可導致細胞從底物脫離。在初代培養時，如發現成肌細胞（Myoblast）所占比例很少時，根據成肌細胞比非成肌細胞貼壁慢的特點，可采用胰蛋白酶消化后反復貼壁法，淘汰掉非肌細胞成分。骨骼肌細胞可進行傳代培養，使之成為有限細胞系；但易失去分化現象；表現為成肌細胞不發生融合，從而不能形成多核肌纖維和出現收縮現象，只有培養條件良好時，才可發生肌細胞收縮變化。
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