腫瘤在不同氧氣量的代謝相互作用（一）

腫瘤在不同氧氣量的代謝相互作用

Monitoring the interplay between oxygen availability and metabolism in tumour biology

Conn Carey¹ , Michelle Potter² , Luned Badder², Karl Morten²,, James Hynes¹
1 Luxcel Biosciences Ltd, Cork, Ireland
2 Nuffield Department of Obstetrics & Gynaecology, Uni. Oxford, Oxford, United Kingdom

要詳細了解腫瘤生物學, 關鍵是知道氧氣量和代謝之間的相互作用關系。 盡管有充足可用的氧，腫瘤偏向缺氧代謝會導致糖酵解增加，也會引起轉錄反應改變和遺傳不穩定性，這種現象被稱為Warburg效應。但是，由于缺乏有效的體外工具能夠測量這些參數，科研人員對氧氣量和關鍵的代謝指標改變所知非常有限。

越來越多科研人員發現現有的細胞培養條件是在高氧狀態 （hyperoxic state）下進行的。現在更多科學家希望采用跟生理狀態更接近的氧濃度進行培養。 然而，控制環境氧濃度相對容易，但關鍵信息是細胞/組織的臨界氧濃度 (tissue oxygenation) 。在這里，我們向您推薦一種新型的熒光板閱讀器 (BMG Labtech Omega /ACU細胞專用讀板機) 配合Luxcel 公司新開發的試劑盒，可以并行監測細胞內的氧氣濃度（MitoXpress-Intra）和糖酵酵解通量glycolytic Flux（pH-Xtra?）。

這種測量可以詳細了解細胞真實的含氧量及其所帶來的糖酵解活動水平。 實驗使用BMG Labtech Omega /ACU細胞專用讀板機配備大氣控制單元（ACU）進行模擬腫瘤脫氧環境，數據揭示細胞單層和所在的環境氧氣濃度有著顯著差異，該差異在一般體外分析中是不太會注意到的。

Fig 1

測量原理是基于細胞內吞MitoXpress Intra?氧氣探針，胞內氧氣能淬滅探針所發出的熒光信號。隨著細胞的呼吸作用，細胞內的氧濃度降低甚至耗盡， MitroXpress Intra?探針所發出的熒光信號，被淬滅的越來越少，熒光信號則相對越來越強。 通過比例測量時間分辨熒光強度（Fig 1）。實現實時測量細胞內的分子氧瞬時變化，該系統也能對多個樣品的代謝活性瞬態變化進行快捷的分析，跟傳統細胞外檢測方法比較，能提供更全面的缺氧研究參數。

此外，通過Luxcel pH-Xtra 探針測量（在平行井，或同一井）胞外酸化率 (ECA) ,可同時監控細胞糖酵解通量 （glycolytic flux），評估細胞的能量潛力（Energy Budget）。數據顯示代謝中的細胞單層（或3維細胞團）的氧濃度跟實驗施加的氧氣濃度，有著顯著差別；特別是在生理相關的氧濃度，其影響更大，從而影響細胞的氧化磷酸化和糖酵解ATP通路平衡。

測量胞內氧氣

通過測量細胞單層內的氧化率，可以評估一些細微短暫的代謝活動變化，這是一般標準的胞外氧耗率測量做不到的。胞內氧化率也允許評估特定激動劑對代謝的詳細影響。樣本數據列于Fig2。

Fig 2.

Fig 2. 抗霉素 (Antimycin) 及FCCP對HEK293T細胞單層的氧化水平的影響。抗霉素是一個ETC抑制劑，而FCCP則是ATP合成抑制劑。探針信號開始時反映了穩定態的氧水平，由于細胞消耗氧，所以這水平較環境氧水平低。抗霉素抑制氧氣消耗，導致氧彌散到單層并把濃度升回到周邊空氣中的含量。 FCCP導致增加氧氣消耗，所以細胞單層中的氧濃度迅速下降直到新的穩定狀態。

Fig 3.

Fig 3.降低未經處理（呼吸）和抗霉素處理（非呼吸）細胞周邊氧濃度并監測單層氧的變化。通過Fig3 BMG Labtech Omega/ACU讀板機把氧濃度步退到21％至5％之間。MitoXpress? Intra 信號反映了細胞層實際的氧濃度。注：細胞呼吸驅使細胞單層的氧濃度比ACU設計的濃度更低，在低氧環境下其影響為更明顯。

測量糖酵解（ECA）

Fig4.

Fig4. pH-XTRA：pH反應(A)，原始數據輸出(B)，測量糖酵解抑制(C)
A）光學特性：經同質修正后pH探針的發射光譜在pH =7.5，7，6.5 及6。注意在pH值為7.5及6間信號增加7.5倍
B）原始數據輸出：Fig3列出梯度稀釋HepG2細胞濃度。增加細胞數量造成酸化率增加。％CV值 <5％顯示實驗數據的高重復性。
C）測量糖酵解抑制：加入2DG后因競爭性抑制減少葡萄糖攝取。 處理后的細胞表現出戲劇性及即時性和對劑量依賴的胞外酸化率下降現象。