腫瘤微環境分析指導癌癥治療

　　在免疫療法時代，癌癥生物學家依靠新一代工具來了解腫瘤和免疫細胞之間的相互作用是如何影響疾病進程的。

　　雖然Sean Bendall是一名病理學家，但最近卻成了一名圖譜制作者，他使用尖端的蛋白質繪圖技術來描繪出腫瘤組織的變幻莫測的景觀。

　　這項技術由Bendall在加州斯坦福大學（Stanford University）的同事Michael Angelo開發。該技術能針對癌細胞及其近鄰區域進行細致的分子譜繪制——最著名的應用是測繪腫瘤內外的免疫細胞。Bendall得到的一些證據表明，這些圖譜可以幫助臨床醫生為某些病人選擇合適的治療方案。在2018年的一項研究中，Bendall和Angelo使用他們的技術（被稱為多重離子束成像（multiplexed ion beam imaging, MIBI）檢測曾接受三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，一種特別具有攻擊性的腫瘤類型）標準化療的病人的腫瘤標本的結構性腫瘤免疫微環境。結果，Bendall等人發現了一種能夠高度預測長期無病生存的免疫微環境類型。

　　一個常見的誤解是，腫瘤組織由兩種細胞組成，即由異常或健康的細胞組成。但現實遠比這個復雜：癌細胞與免疫細胞、血管和支持結締組織廣泛相互作用。這種腫瘤的“微環境”可以深刻地影響疾病的特征和患者對治療，特別是免疫療法的反應，免疫療法是一種可以提高機體免疫系統對腫瘤殺傷作用的治療方法。例如，微環境可以決定附近的免疫細胞是否“開啟”或“關閉”，或者甚至是否能夠接近腫瘤。正如紐約紀念斯隆-凱特琳癌癥中心（Memorial Sloan-Kettering Cancer Center）的計算生物學家Dana Pe'er所說， 腫瘤不僅僅是一堆同質細胞，它實際上是一個器官——一種嚴重畸形的器官。

　　利用MIBI之類的腫瘤繪圖技術，以及基于基因表達或蛋白質含量對大量單個細胞進行詳細普查的其它方法，研究人員現在正在剖析腫瘤微環境的結構和功能。這些工具是如此新穎，以致許多研究人員仍然在摸索如何能最佳地利用這些工具。但由此產生的見解可能有助于開創一個新的腫瘤剖析時代——一個通過深度分析腫瘤微環境，收集例如其中存在的免疫細胞的數量和類型之類的信息，而不是專注于個體遺傳變異，最終得到細胞生態系統的“全局”視圖的時代。

　　紐約市西奈山伊坎醫學院（Icahn School of Medicine）的腫瘤內科醫生Miriam Merad表示，這些功能確實會對癌癥治療產生影響。

　　細胞普查

　　腫瘤和免疫系統之間的相互作用可能會影響人類疾病，這個觀點并不新鮮——50年來，免疫學家Wolf Fridman基于對白血病中名為T細胞的免疫細胞反應的早期觀察，一直在研究這種相互作用。Fridman指出，很快他就確信免疫反應的位置和組織非常重要。Fridman現在是巴黎笛卡爾醫學院（Medical School Paris Descartes）的名譽教授。然而，直到大約十年前，隨著強大的免疫治療策略的出現，這些相互作用的廣泛影響才成為腫瘤學家的主要焦點。

　　病理學家可以用蘇木精和伊紅（haematoxylin and eosin, H＆E）染色和免疫組織化學（immunohistochemistry, IHC）等常規技術獲得腫瘤免疫細胞組成的信息。IHC使用識別組織標本中特定分子特征的酶標記抗體，已被證明能為檢查點抑制劑類藥物的使用提供重要指導信息。免疫檢查點治療劑的作用機制是阻斷那些抑制局部免疫細胞攻擊腫瘤的特異性信號傳導蛋白，而IHC可以揭示這些蛋白質的存在。Bendall提醒，如果患者肺部腫瘤中檢查點蛋白質表達很低，那么使用檢查點抑制劑就基本不會有效果。然而，許多表達這些蛋白質的患者對檢查點抑制劑也沒有響應，研究人員正在尋找可能更清楚地預測治療是否有效的其它疫特征。但IHC并不是發現這些特征的最佳策略，因為它一次只能分析少數分子標記。

MIBI得到的腫瘤和免疫細胞的分子譜。細胞被染上色，以顯示其距腫瘤邊界的距離（左）或遺傳標記的表達（右）。

　　飛行時間質譜流式細胞術（Mass cytometry by time-of-flight, CyTOF）可以對更多的腫瘤細胞進行分析。常規流式細胞術將抗體偶聯到染料或熒光標記上，而CyTOF使用與金屬同位素連接的抗體來標記來自腫瘤樣本的大量細胞。質譜儀能夠非常快速地分析這些同位素標簽，并行地為每個細胞檢測和量化數十種不同的標記物。

　　2017年，Merad等人將CyTOF應用于肺腺癌（lung adenocarcinoma）——一種最常見的肺癌形式，并使用多達40種不同的標簽抗體來標記細胞。他們的數據揭示了新出現的腫瘤如何通過招募免疫抑制調節性T細胞，并阻止包括殺死腫瘤的自然殺傷細胞在內的“效應細胞”的遷移來迅速抑制病人的免疫反應。Merad指出，即使在腫瘤開始變得惡性的早期階段，腫瘤細胞都會想辦法抑制這些效應細胞。這些結果表明，在腫瘤發展的早期逆轉免疫抑制可能會阻止腫瘤進展，并有望阻止轉移。

　　分析轉錄物

　　CyTOF需要事先了解細胞類型特異性標記，以便研究人員選擇合適的抗體。Peer指出，CyTOF的一個局限性是，幾乎沒有提供有關生物功能的直接信息，只提示細胞標記的存在與否。

　　諸如RNA測序（RNA sequencing, RNA-seq）的轉錄組分析技術可以提示一些功能方面的信息。RNA-seq采用高通量測序平臺來表征和定量大量蛋白質編碼信使RNA轉錄本。這提供了一個直接的窗口，可用于觀測哪些基因在給定的細胞中被關閉和打開，從而揭示腫瘤中發生的生物活動。十多年來，研究人員一直在應用這些技術，但其中大部分都是“大量”分析——一次性分析腫瘤中的每個細胞。馬薩諸塞州劍橋市博德研究所（Broad Institute）的計算生物學家Aviv Regev指出，雖然這種方法可以提供有用的見解，但也可掩蓋了細胞之間的差異。

　　Regev的實驗室開發了一種名為Drop-seq的方法，該方法將單個細胞封裝在單個脂滴中，經預處理后便可進行測序。在此過程中，每個細胞的RNA都會有一個不同的遺傳條形碼，從而直接確定哪些轉錄物來自同一細胞。Regev表示，他們得到的結果非常全面——豐富的細胞類型，以及豐富的分子種類。至關重要的是，和其它單細胞RNA-seq方法不同，Drop-seq不需要事先知道感興趣的基因、基因表達譜，以及可以用于重建細胞之間的相互作用。Regev去年針對黑素瘤腫瘤的研究中證實了Drop-seq技術的這種獨特優勢。Regev等人發現惡性細胞實際上可以呈現一種特定的狀態，它們形成所謂的‘冷的生態位’（cold niches），那里沒有T細胞。可想而知，這樣的腫瘤區域對免疫療法更具抗性。

　　單細胞RNA-seq（scRNA-seq）的實施相對簡單，目前有幾種商業儀器可供使用。但該技術仍然存在一些重要挑戰。也許最重要的是腫瘤標本必須直接從手術室運輸到實驗室，中間的流轉時間必須短。Merad指出，單細胞方法僅對新鮮細胞提供信息，因為當我們冷凍和解凍細胞時RNA很快就會降解。

　　然而，該技術可以揭示其它方法無法揭示的細胞類型和細胞狀態，并揭示免疫細胞功能的細微差別，傳統用于分類細胞的簡單類別完全不足以涵蓋這些細微差別。Pe'er表示，免疫細胞之間的差異和子類型遠比我們想的要多，我們過去常喜歡根據細胞是促癌還是抑癌，將其分類為好的和壞的，但系統要復雜得多，大多數細胞既有好的一面，又有壞的一面。

　　各種技術的利與弊

　　盡管CyTOF和RNA-seq功能強大，但是還需要進行嚴格的權衡，因為它們需要破壞腫瘤組織才能得到單個細胞。破壞組織意味著丟失空間細節，而這些細節對于理解惡性細胞與其微環境之間的相互作用非常重要。諸如IHC和H＆E染色之類的方法捕獲了這些空間細節，但是單個實驗只能揭示有限的信息，無法得到整個微環境的全局視圖。Bendall指出，他曾看到過他們部門的病理學家把幻燈片放在一起，一張張看，從而觀察多個特征。2014年開發的兩種成像技術可以提供豐富的空間數據，而無需把多張圖片堆在一起整理數據。

　　第一種成像技術是質譜流式細胞成像術（imaging mass cytometry, IMC），由瑞士蘇黎世大學（University of Zurich）的Bernd Bodenmiller等人開發。與常規CyTOF一樣，IMC樣品采用金屬同位素標記的抗體，但在Bodenmiller的技術中，抗體標記在完整組織上，而不是解離的細胞上。然后用激光掃描樣本，破壞組織并釋放同位素標記，再用CyTOF分析。這使得研究人員能夠在完整樣品上以亞細胞分辨率同時測量數十種標記物，其細節水平大大超過IHC。Bodenmiller表示，IMC能分析的細胞/分子數量比IHC多幾個數量級，這為免疫標記物的分析帶來了更多的定量信息。

　　第二種技術是Angelo和Bendall在斯坦福大學（Stanford University）的免疫學家Garry Nolan的實驗室工作時開發的MIBI。MIBI同樣使用同位素標記的抗體標記樣本，然后用掃描離子束從樣本中釋放出這些標記，但MIBI使用不同類型的質譜儀進行同位素分析。Angelo和Bendall繼續完善這一平臺，以提高其速度和易用性，正如他們在2018年針對三陰性乳腺癌的研究所強調的那樣。Bendall指出，過去常常需要花費近一天來獲取一張小圖片，但他們最終在大約一周半內對大約40名患者的樣本進行了分析，并分別獲取了毫米大小的方形圖像。

　　雖然這兩種技術僅用于少數已發表的研究，但MIBI和IMC已經證明了獲取細胞在腫瘤微環境中的空間位置相關信息的價值。Bodenmiller指出，大家都說腫瘤是高度異質和隨機的系統，但他們發現很多結構和細胞間的相互作用并不是隨機的。

　　Merad警告稱，IMC和MIBI現已上市，但學習這兩種技術并不簡單。這些基于質譜的系統容易受到很多因素的干擾，她認為現場需要一名工程師來保護設備免受移動和光線等環境因素的影響。雖然可以獲得越來越多的同位素標記抗體，但開發和優化新探針可能是一個艱苦的過程。Bodenmiller也指出，這些基于質譜的方法可能不如IHC的熒光變體靈敏，后者通常使用信號放大策略，即使是非常稀缺的蛋白質也能被可視化。

　　瑞典皇家理工學院（KTH Royal Institute of Technology）的基因組學研究員Joakim Lundeberg和斯德哥爾摩卡羅林斯卡醫學院（Karolinska Institute）的干細胞生物學家Jonas Frisén設計了一種更簡單，但分辨率更低的替代技術。他們開發的空間轉錄組學方法需要將腫瘤標本直接放置在排列有數千個寡核苷酸的載玻片上，使得樣品的每個區域對應于不同的序列條形碼。然后使組織可滲透，使其mRNA擴散出來并被固定的寡核苷酸捕獲。接著，剩余的組織被清理掉，使用測序儀對載波片上的RNA進行測序，相關的條形碼便能顯示每個轉錄物在原組織中的位置。

　　這種空間轉錄組學方法缺乏單細胞細節，但它捕獲了在蛋白質水平難以獲得的信息，特別是對于稀缺或分泌到細胞外空間的蛋白質。在去年發布在bioRxiv預印本服務器上的一篇論文中，Lundeberg的團隊使用這種方法來描述乳腺腫瘤中的免疫細胞活性。他指出，他們可以在一次活檢中看到，在腫瘤的一部分有免疫細胞浸潤腫瘤，而在同一腫瘤的另一端，免疫細胞僅在腫瘤外圍分布，而不滲入腫瘤。

　　新型診斷方法

　　這些方法的臨床效用已得到了初步證實。2017年Bodenmiller和Pe'er之間的合作表明，某些免疫譜可以為患有某種形式的腎癌患者提供預后。Bodenmiller等人基于數據，得出了一個方程式，他們可以用它來計算這些患者的無進展生存期。同樣，Merad和Regev利用腫瘤微環境調查的見解來確定可能克服肺癌、乳腺癌和其它癌癥中的耐藥性和免疫抑制問題的治療療程；目前這些治療課程的臨床試驗正在準備中。

　　然而，構建用于全面微環境分析的實驗和分析管道可能給臨床設施帶來沉重負擔。Merad的部門組建了一個由外科醫生、病理學家、技術專家和癌癥生物學家組成的緊密集成的團隊，以及數百萬美元的尖端器械庫，其中包括三臺CyTOF機器、三臺單細胞RNA-seq儀器和一個MIBI平臺。她表示，這項技術非常昂貴，且屬于勞動密集型，而且他們還有許多東西仍處優化階段。她從未如此興奮，但也從來沒有那么累。

　　對于許多癌癥中心來說，這樣的投資是遙不可及的，但這些開創性設施的研究結果很快就會滲透到更廣泛的社區，揭示能用較便宜的技術進行檢測的生物標志物和疾病概況。諸如人類細胞圖譜（Human Cell Atlas）之類的國際合作項目正在整合可公開獲取的“指南”，以指導基于基因組學、轉錄組學和蛋白質組學的數據對細胞，尤其是腫瘤微環境中的細胞來進行分類。作為“泛癌癥圖譜”（Pan-Cancer Atlas）計劃的一部分，包括華盛頓州西雅圖系統生物學研究所（Institute for Systems Biology in Seattle）的計算生物學家Ilya Shmulevich在內的研究人員已經分析了超過1萬個腫瘤標本的免疫和腫瘤細胞組成。Shmulevich指出，這些數據已經存放在癌癥研究所（Cancer Research Institute）的iAtlas庫（一個免費提供的數字資源，臨床研究人員可能有一天會用它來對自己的樣本進行分類）中。

　　重要的是，即使在不同的腫瘤類型中，微環境似乎也存在相當大的共性。作為Pan-Cancer Atlas工作的一部分，Shmulevich等人根據腫瘤的免疫狀態，將代表33種不同癌癥類型的各種腫瘤分為6類。反過來，這些亞型反映了人體免疫系統對腫瘤的反應，因此可能可以預測免疫療法的成功程度。Shmulevich的團隊與紐約州立大學石溪分校（Stony Brook University）的計算生物學家Joel Saltz合作，隨后發現，可以使用機器學習分析傳統H&E染色的結果，從而識別免疫細胞組織模式。他表示，你可以看到各種細胞的空間信息，以及T細胞的聚集狀態，或者它們與腫瘤邊緣的接近程度，這些信息現在能提供診斷信息，甚至可能提供預后信息，還可預測患者對治療的反應。

　　Pe'er現在希望技術發展的腳步能放緩，從而讓更多的科學家能迎頭趕上。她表示，她們剛開發了一堆新工具，現在她們需要開發更多的計算方法，從更多的隊列中收集更多的患者數據，以了解這些工具能告訴人們哪些信息。

　　原文檢索：

　　Michael Eisenstein. (2019) Cellular censuses to guide cancer care. Nature, 567: 555-557.