胰島素受體與[125I]胰島素的交聯實驗

純化的鼠肝細胞質膜 部分純化的胰島素受體 純化的胰島素受體 [125I] 胰島素 豬胰島素 雙琥珀酰亞胺酰辛二酸 二甲亞砜 NH4Cl 甘油 SDS-PAGE 樣品緩沖液

蛋白質凝膠電泳裝置 干膠器

材料與設備

純化的鼠肝細胞質膜（見本單元實驗 1)

部分純化的胰島素受體，得自 WGA-瓊脂糖柱層析（見本單元實驗 3)

純化的胰島素受體，得自胰島素瓊脂糖柱層析（見本單元實驗 4)

[¹²⁵I] 胰島素（受體級）（DuPont NEN NEX 196)

豬胰島素（17.5umol/L)(如，Sigma Chemical Co.13505)

雙琥珀酰亞胺酰辛二酸（Pierce Chemical Co.21555)

二甲亞砜（DMSO)

NH₄Cl(1mol/L)

甘油（10%;v/v)

蛋白質凝膠電泳裝置（BioRad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)

干膠器 (Bio-Rad Laboratories 或 Hoefer Scientific Instruments)

試劑

SDS-PAGE 樣品緩沖液（5x)

(配方，見 試劑的配制，pp.234~240)

操作程序

1）建立如下反應體系:



2) 反應混合物于室溫孵育 2 h。

3) 溶雙琥珀酰亞胺酰辛二酸于 DMSO 中，使終濃度為 10 mmol/L。

4) 每管加入 6ul 10 mmol/L 雙琥珀酰亞胺酰辛二酸，室溫孵育 1 min。

5) 加1ul 1mol/L NH4Cl 終止反應。

6) 加 15ul 5xSDS-PAGE 樣品緩沖液。

7) 樣品煮沸 5 min。

8) 加樣至 7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上。170V 電壓下電泳，至染料前沿跑出凝膠。（關于 SDS-PAGE 的詳細資料，見附錄 5)

9) 將凝膠置 10% 甘油中孵育后，在干膠器上干燥。
注：蛋白質也可轉移至硝酸纖維素膜上，如本單元實驗 6 所述。

10）用放射自顯影法鑒定親和標記的胰島素受體。

結果

交聯實驗的典型結果如圖 4-6 所示。