摘 要： 目的 建立一種快速、簡易的檢測血清中抗幽門螺桿菌(Hp)細胞毒素相關蛋白A(CagA)抗體的膠體金免疫層析法(GICA)。 方法 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標記葡萄球菌A蛋白(SPA)，將重組 的CagA抗原劃線固定于硝酸纖維素膜上，制成免疫層析檢測試條。 血清中IgG與測試條上金標記物結合后沿著硝酸纖維素膜移動，與膜上的固相抗體結合形成肉眼可見的紅色線條。 結果 用GICA與ELISA試劑盒對比檢測了326份血清標本中抗CagA抗體，本方法的特異性為95.8%，敏感性為97.3%，兩法符合率為96.6%。 結論 GICA檢測血清中的抗CagA抗體特異性強、靈敏度高、簡便快速，無需特殊儀器設備，有廣泛應用價值。
關鍵詞：螺桿菌，幽門;細胞毒素相關蛋白A/ 分析;膠體金;免疫 層析;抗體/ 分析
中國圖書館分類號 R 573
一、引言
幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp) 與上消化道疾病的發生有十分密切的關系。 國外報道，人群中約有一半感染了Hp，其中約50%的Hp菌株表達細胞毒素相關蛋白A(cytotoxin associated gene A protein, CagA)。 目前國內尚缺乏CagA陽性Hp感染的流行病學資料。 我們擬建立簡單而快速檢測抗Hp-CagA抗體的膠體金免疫 層析法(gold immunochr_omatography assay, GICA)。
二、材料和方法
1、材料 氯金酸(HAuCl·Cl3·4H2O)：成都化學試劑廠產品：葡萄球菌A蛋白(SPA)：衛生部上海生物制品研究所 ;細胞毒素相關蛋白A(CagA)：基因工程產品，本所制備;酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測抗CagA-IgG試劑盒：上海晶瑩生物制品公司;血清標本：由第四軍醫大學中心血庫及消化內科提供;Z 323 K低溫高速離心機：德國;LGJ 0.5-Ⅱ冷凍干燥機：軍事醫學科學院實驗儀器廠;點膜器：美國Bio-Dot公司。
2、 方法
(1)15 nm膠體金的制備 參照文獻[4]進行。 其步驟為：去離子水 溶解氯金酸使其終濃度為0.2 g/ L，煮沸后每100 mL加入10 g/ L檸檬酸三鈉水溶液4 mL，繼續煮沸7min. 電鏡觀察膠體金的粒度。
(2) 免疫膠體金的制備 取顆粒直徑為15 nm的膠體金100 mL，用0.1 mol/ L K2CO3調至pH 6.2，在攪拌狀態下加入SPA(1 g/ L) 0.6 mL，繼續攪拌10min;加入50 g/ L BSA 10 mL，繼續攪拌5min. 4℃下3000 r/ min離心5min，棄沉淀，上清液以12 000 r/ min離心15min，小心移去上清液，沉淀即為制備的膠體金。 用20 mL懸浮液懸浮沉淀，以吸水纖維吸附后冷凍干燥4 h，4℃保存備用。
(3)免疫層析測試條的制備 測試條由吸水纖維、硝酸纖維素膜和吸水濾紙三部分組成。 吸水纖維部分附著有膠體金免疫復合物;在硝酸纖維素膜上用CagA(1.5 mg/ L)及人IgG(1 mg/ L)劃線(1 mm寬)，分別作為檢測線和對照線，晾干，用50 g/ L BSA封閉2 h，以0.01 mol/ L PBS洗滌3次，干燥后依次粘于白色塑料片(支持物)上，切成0.5 cm×10 cm的試條，加干燥劑密封保存。
(4)抗Hp-CagA IgG的檢測 以新鮮血清為佳。 試管中加入0.1 mL～0.2 mL血清，將測試條含有金標記物的一端插入血清內即可。 結果判定：以測試條硝酸纖維素膜上出現兩條紅色條帶為抗Hp-CagA IgG陽性;僅出現一條紅色條帶(靠近吸水濾紙端，對照線)為陰性。 如果無紅色條帶出現則視為試劑失效。 結果確定時間：強陽性標本在5min內即可在檢測線處見到紅色膠體金顆粒聚集;弱陽性標本約需要10min確定結果。
三、結果
1、膠體金顆粒直徑的電鏡觀察 用預先處理好的覆蓋有Formvar膜的鎳網侵入膠體金溶液中，取出放入空氣中干燥，然后在透射電鏡下觀察，可見膠體金顆粒大小均勻一致，顆粒直徑約為15 nm(圖1)。
圖1 膠體金顆粒的透射電鏡觀察結果。
2、試劑盒的特異性及敏感度 采用本實驗所建立的膠體金免疫層析法與ELISA試劑盒對比檢測西京醫院門診及住院326例患者血清中的抗Hp-CagA IgG，結果見表1.
表1 GICA與ELISA檢測結果比較
ELISA 合計
+ -
GICA + 178 6 184
- 5 137 142
合計 183 143 326
由表1可見，若以ELISA檢測抗Hp-CagA抗體試劑盒作為參照標準，則GICA法的特異性為95.8%，敏感度為97.3%，總符合率為96.6%。
3、穩定性試驗 GICA試劑盒于4℃下放置6 mo，每月檢測抗Hp-CagA IgG陽性及陰性血清各50份，該試劑盒的各種性能指標均穩定。 將GICA試條于37℃溫箱放置6 d，做熱穩定性試驗，與放置4℃的試條對照，結果無明顯差別。
三、討論
免疫層析是出現于20世紀80年代初期的一種獨特的免疫分析方式。 Beggs et al[1]于1990年首次報道了斑點免疫層析試驗(dot immunochromatographic assay, DICA)，用以檢測孕婦尿液中的HCG進行早孕診斷，繼而有采用該方法檢測乙型肝炎病毒表面抗原[2]及抗HCV-IgG[3]的報道。 本文建立的膠體金免疫層析快速檢測抗Hp-CagA抗體的方法集中了免疫與層析色譜的特點，使待測樣品中的IgG與吸水纖維上的金標SPA不斷結合，形成IgG-金標SPA復合物，再由層析作用，持續通過硝酸纖維素膜，與膜上固相CagA結合。 該方法具有以下特點：①敏感度高：由于在試驗中所有樣品均經過狹窄的硝酸纖維素膜，實際上是對被測的物質起到了濃縮的作用，從而使免疫層析比免疫滲濾法更為敏感，與ELISA檢測的敏感度相近。 ②特異性強：本試劑盒采用高活性的重組CagA純品作抗原，極大地提高了檢測的特異性。 膠體金及免疫膠體金的性能，也是影響特異性的一個重要因素。 研究中我們結合有關文獻[4-6]，經過不斷的試驗，制備了適合本方法開展的直徑為15 nm的膠體金顆粒，并最大限度地提高標記的效率。 ③穩定性及重復性好：免疫膠體金的穩定性是影響試劑盒質量的一個重要因素。 免疫膠體金的制備，是金顆粒表面吸附蛋白質以形成牢固結合的過程。 該過程受酸堿度、離子強度、免疫膠體金的濃度、溫度等因素的影響，其中主要取決于pH值。 為此，我們優化了膠體金標記的最佳條件和免疫膠體金懸浮的最佳配方，使該試劑保存時間延長。 ④操作簡便：本試劑盒的核心部分僅為一個試條，構造十分簡單;結果顯示為紅色的條帶，判斷非常容易;操作更是方便，不需任何設備，特別適應于中小型醫院， 醫師診所和急診檢驗，并可在家中測試。 ⑤快速：GICA操作過程一般僅需幾分鐘，最長不超過10min;而在ELISA操作中，由于涉及加血清、標記物、底物及繁復的洗板等步驟，約需2 h方可完成。
研究表明，CagA陽性Hp感染與上消化道疾病的關系更為密切[7-9]。 來自亞太地區的研究提示，Hp感染者中CagA陽性Hp感染率相當高[10-12]。 為適應大面積的CagA陽性Hp的篩選，本文所建立的檢測血清中抗CagA IgG的方法無疑對于CagA陽性Hp感染的快速診斷有重要意義。 由于GICA檢測血清標本中抗CagA IgG具有特異性強、靈敏度高、穩定性好、簡易快速、無須儀器設備等優點，因而有廣泛應用前景。
通訊作者 韓鋒產，710033，陜西省西安市長樂西路17號，第四軍醫大學全軍基因診斷技術研究所。
作者簡介：韓鋒產，男，1963-05-08生，陜西省咸陽市人，漢族。 1985年延安大學醫學系畢業，1990年西安醫科大學生物化學碩士，1995年第四軍醫大學生物化學博士，主要從事基因診斷方面的研究工作，發表論文12篇。
Correspondence to:HAN Feng-Chan, Chinese PLA Institute of Gene Diagnosis, Fourth Military Medical University, 17 Changle Xilu, Xi'an 710033, Shaanxi Province, China
Tel. +86·29·3374771
Email.Hanfc@263.net
四、參考文獻
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