(2)0、5mol/L,pH7.4 Tris-Hcl緩沖液:Tris,60.57g,1mol/L Hcl約420m1,調pH值至7.4,最后加雙蒸水至1000m1,此為儲備液。
(3)0、05mo1/L Tris緩沖生理鹽水:氯化鈉8.5-9g;0.5mo1/L,pH7.4 Tris-Hcl緩沖液100m1;加雙蒸水至1000m1,調pH值至7.4.
(4)0、02mo1/LTris緩沖生理鹽水:氯化鈉8.5-9g;o.5mo1/L,pH7.4 Tris-Hcl緩沖液40m1,加雙蒸水至 l000m1,調pH值至8.2.
(5)0、5mo1/L,Triton-Tris緩沖生理鹽水:Tritonx-100 l0m1;0.5mo1/L,pH7.4 Tris- Hcl緩沖液100m1,加雙蒸水至l000m1,調pH值至7.4.
2、具體步驟:
(1)0、05mo1/L TBS(pH7.4)洗5min×3次。
(3)1:5正常羊血清(0.05mo1/L TBS PH7.4)37℃孵育l h,阻斷非特異性吸附,吸去多余血清,不洗。
(4)特異性一抗(抗體稀釋度較常規免疫組化低l倍)室溫孵育24h.
(5)0、05mo1/L TBS pH7.4,洗5min×3次。
(6)0、02mo1/L TBS PH8.2,洗5min×3次。
(7)1:5正常羊血清(0.02mo1/L TBS pH8.2)37℃孵育l h,再次阻斷非特異性吸附,吸去多余血清,不洗。
(8)生物素化膠體金標記二抗(原液)37℃孵育2h.
(9)0、02mo1/L TBS pH8.2,洗5min×3次。
(10)0、05mo1/L TBS pH7.4,洗5min×3次。
(11)最后切片浸于o.05m01/L TBS pH7.4緩沖液中,送電鏡室處理。
無DNA酶的胰RNA酶 將胰RNA酶溶解于10mmol/LTris-Hcl(PH7.5),15mmol/LNaCl中,配成10mg/ml的濃度,與100度加熱15分鐘,緩慢冷卻至室溫,分裝成小份-20度保存。
3、病毒液體的膠體金技術
(自:傅倉生,膠體金免疫電鏡技術用于煙草花葉病毒的檢測,植物病理學報,VoL.24,No.4,353—355)1.3.1 外標記標本制備:
(1)以帶膜銅網蘸取純化病毒懸液,PBS沖洗。(2)在相應的抗血清中室溫孵育20分鐘,PBS沖洗。(3)在PAg(1:50稀釋)中室溫孵育
20分鐘,PBS沖洗。(4)1%醋酸鈾負染,H500電鏡觀察,拍照。
內標記標本制備:
(1)以感染煙草花葉病毒的普通煙葉的試料,電鏡常規制樣,超薄切片。(2)在TMV抗血清中室溫孵育l小時,PBS沖洗數次。(3)在PAg(1:50稀釋)中室溫孵育1小時,PBS沖洗數次,三蒸水沖洗數次。(4)醋酸鈾一檸檬酸鉛雙染色,H500電鏡觀察,拍照。
(自:翟雷,樸曉萍,潘萍等。微生物學免疫學進展,1995,24(3):17-19.免疫膠體金試劑的制備及應用膠體金免疫電鏡技術檢測戊型肝炎病毒)取樣品100
ul分別于微量離心管,各加100 ul鼠抗HEV單克隆抗體(1:500一1000稀釋),混勻,
37℃溫箱作用60min,雙蒸水充滿管,13000 rPm離心30 min,棄上清。沉淀用100
ul雙蒸水懸浮,加l00ul膠體金標記免抗鼠IgG,溫勻,置37℃溫箱作用 60
min.雙蒸水充滿管,13000rPm離心30min,棄上清,沉淀用l00ul雙蒸水懸浮,滴于鍍膜銅網,干后3%PH7.4的PTA負染,電鏡觀察。
(自:滴一滴NDV于銅網上,室溫吸附15分鐘,然后用0.1%的PBS洗5次,吸去余液;加一滴金標抗體于銅網上,37度作用20分鐘,PBS洗 5次,吸去余液,然后用磷鎢酸負染5分鐘,干燥后電鏡觀察。
(自:梁紅,譚紅英,蔡景霞等。蛋白A膠體金免疫電鏡負染技術檢測脊髓灰質炎病毒和SV40病毒,中華微生物和免疫學雜志,1998,9(2):111-112)
取抗原抗體各50UL在血凝板孔中37度,45分鐘。加OD值為0.2膠體金50UL,37度,45分鐘。取抗原抗體膠體金混和物50UL,于銅網,室溫30分鐘。膠體金緩沖液洗兩次,雙蒸水洗一次,磷鎢酸負染,電鏡檢查。